310 10*1mm rustfritt stål kveilrør kjemisk komponent, de N-terminale domenene til spidroin danner hydrogeler basert på amyloidfibriller og gir en plattform for proteinimmobilisering.

Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Skyveknapper som viser tre artikler per lysbilde.Bruk tilbake- og neste-knappene for å gå gjennom lysbildene, eller lysbildekontrollknappene på slutten for å gå gjennom hvert lysbilde.

Spesifikasjon

310 10*1mm Rustfritt stål kveilrør leverandører

Kjemisk oppbygning

Mekaniske egenskaper

Rekombinante edderkoppsilkeproteiner (edderkoppsilkeproteiner) har mange potensielle anvendelser i utviklingen av nye biomaterialer, men deres multimodale og aggregeringsutsatte natur gjør dem vanskelige å få tak i og enkle å bruke.Her rapporterer vi at rekombinante miniatyr spidroinproteiner og, viktigere, det N-terminale domenet (NT) i seg selv raskt danner selvbærende og transparente hydrogeler ved 37 ° C.fusjonsproteiner bestående av NT og grønt fluorescerende protein eller purin-nukleosid-fosforylase danner fullt funksjonelle fusjonsproteiner.Hydrogeler.Resultatene våre viser at rekombinante NT- og fusjonsproteiner gir høye ekspresjonsutbytter og gir hydrogeler attraktive egenskaper som gjennomsiktighet, gelering uten tverrbinding og direkte immobilisering av aktive proteiner ved høy tetthet.
Edderkopper har så mange som syv forskjellige sett med silkekjertler, som hver produserer en bestemt type silke.Alle de syv silkeartene er sammensatt av edderkoppsilkeproteiner (spidroiner) omtrent 6000 rester lange og inneholder et stort sentralt repetert område omgitt av sfæriske N- og C-terminale domener (NT og CT)1,2.Den mest studerte typen silke, den primære ampulla, produseres av den primære ampulla kjertel.I denne kjertelen syntetiserer et monolag av epitelceller spidroinproteiner og skiller dem ut i lumen av kjertelen, hvor de er tilstede i en løselig form (doping) i ekstremt høye konsentrasjoner (30–50 % w/v)3,4.Organiseringen og konformasjonen av de viktigste ampulære spidroinproteinene i kjertelen har vært diskutert, men de fleste eksperimentelle bevis indikerer tilstedeværelsen av en generelt spiralformet og/eller tilfeldig spiralformet konformasjon og micellære eller lamellære strukturer5,6,7,8,9,10.Mens de repeterende domenene regulerer de mekaniske egenskapene til silkefibre, danner β-sheet nanokrystaller og amorfe strukturer11,12,13,14,15, regulerer endedomenene silkefibre som svar på endrede forhold langs silkekjertelen16,17,18.Ved å kontrollere silkedannelsen blir 19. Terminale domener evolusjonært bevart og deres funksjon kan være felles for alle spidroinproteiner 2,20,21.Under passasje gjennom kjertelen synker spidroins pH fra ca. 7,6 til < 5,716 og øker med skjær og strekk mediert av bevegelse gjennom den gradvis avsmalnende kanalen.I løsning er CT en α-helikal konstitutiv parallell dimer17, men som respons på lav pH og skjærkrefter utfolder CT seg og bytter β-lag16, 17, og utløser muligens β-lag i de repeterende områdene til Convert 16. NT er monomere under forhold som reflekterer forhold i lumen av kjertelen og medierer løseligheten til spidroin, men ved redusert pH fører protonering av en rekke karboksylsyresidekjeder til dimerisering av NT med en pKa på ca. 6,5, og stabiliserer derved NT og fikserer spidroin i store mengder. mengder.nettverk16,18.Dermed spiller NT en nøkkelrolle i filamentdannelse, og går fra en monomer i belegget til en dimer i fiberen23,24,25.NT forblir svært løselig og spiralformet under alle forhold som er studert til dags dato16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, noe som inspirerte utviklingen som en løselighetsforbedrende etikett for produksjon av heterologe proteiner.
Rekombinant mini edderkopp silkeprotein, bestående av ett NT, en kort repetisjonsregion, en CT og en His6 tag (His-NT2RepCT) for rensing, er like løselig i vandig buffer som naturlig edderkopp silkeprotein og etterligner naturlige viktige egenskaper til silkeedderkoppen .dekning 25.31.His-NT2RepCT kan spinnes til kontinuerlige fibre ved hjelp av en biomimetisk maskin der et pH 8 løselig belegg ekstruderes inn i et pH 525,32,33,34,35 vannbad.Bioreaktorfermentering av E. coli som uttrykker His-NT2RepCT og påfølgende etterbehandling resulterte i >14 g/L utbytte etter rensing.Det høye utbyttet, høy løselighet og tilstrekkelig respons av His-NT2RepCT til sure forhold tilskrives alle NT23, 25, 34.
Her rapporterer vi den raske dannelsen av transparente hydrogeler fra rekombinante spidroinproteiner, inkludert NT alene, ved å inkubere en proteinløsning ved 37 ° C.Ved å bruke tioflavin T fluorescens (ThT), Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR), kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), fant vi at NT og mikrospider proteiner gjennomgår strukturell transformasjon til β-ark og amyloidlignende fibriller når geler dannes.I tillegg danner fusjonsproteiner av NT og grønt fluorescerende protein (GFP) eller purin-nukleosid-fosforylase (PNP) hydrogeler med fullt funksjonelle fusjonsfragmenter.Høyt gjennomstrømningsuttrykk i heterologe verter, kombinert med rask dannelse av hydrogeler under fysiologiske forhold, åpner muligheten for kostnadseffektiv produksjon av hydrogeler med konstruerte funksjoner.
I motsetning til de fleste rapporterte rekombinante spidroinproteiner36, er His-NT2RepCT stabil i Tris-HCl-buffer ved pH 8 og kan konsentreres opp til 500 mg/ml uten utfelling25.Derfor ble vi overrasket over å finne at dette proteinet raskt danner optisk klare, selvbærende hydrogeler når det inkuberes ved 37°C (fig. 1b-d).Ytterligere studier viste at His-NT2RepCT gelering skjedde over et bredt spekter av proteinkonsentrasjoner (10–300 mg/ml), og at denne konsentrasjonen var omvendt korrelert med geleringstid (fig. 1c og tilleggsfig. 1).For å finne ut hvilke deler av His-NT2RepCT som medierer hydrogeldannelse, undersøkte vi deretter hvert domene individuelt og i forskjellige kombinasjoner ved å bruke en kolbeinversjonsanalyse (Figur 1a,b).Alle testede fraksjoner av rekombinant spidroin dannet geler (ved en proteinkonsentrasjon på 300 mg/ml) på mindre enn 1 time, bortsett fra utfelte 2Rep (fig. 1b).Dette tyder på at NT og CT alene, i kombinasjon, eller assosiert med repetisjoner, kan gelere ved 37°C og at His6-merket ikke påvirker denne prosessen i noen betydelig grad.Gitt den vanlige oppfatningen om at NT er et svært løselig og stabilt protein, og at tidligere rapporter om rekombinante spidroinhydrogeler har tilskrevet geleringseffekter til konformasjonsendringer i gjentatte regioner og/eller CT-er, kunne NT selv.Oppdagelsen av geldannelse var uventet.Supplerende tabell 1) 37, 38, 39. Bemerkelsesverdig nok ga NT allerede i løpet av 10 minutter ved en konsentrasjon på ≥ 300 mg/ml (fig. 1c).Inversjonseksperimenter med hetteglass med forskjellige konsentrasjoner av NT viste at ved >50 mg/mL gelerte NT-løsningen raskere enn His-NT2RepCT ved tilsvarende konsentrasjon (w/v, figur 1c).
Skjematisk representasjon av ulike spidroin-konstruksjoner studert i dette arbeidet.b Geltid ved 37 °C for ulike rekombinante spidroinproteiner (300 mg/ml) bekreftet ved å snu hetteglasset.CT gel umiddelbart uten inkubasjon (<300 mg/ml), 2Rep utfelles (300 mg/ml, 5 mm skala).c Geltid for His-NT2RepCT og NT ved angitte proteinkonsentrasjoner ved 37°C.d Fotografier av His-NT2RepCT og NT hydrogeler med henholdsvis edderkoppen og bokstaven "NT" trykt under (begge 200 mg/ml, skala 5 mm).
Hydrogeler dannet av ulike rekombinante spidroinproteiner har litt forskjellige farger, og observasjon med det blotte øye viser varierende grad av transparens (fig. 1b).NT geler er eksepsjonelt klare mens andre geler blir ugjennomsiktige.His-NT2RepCT og NT geler støpt i sylindriske rør kunne fjernes fra formen intakt (fig. 1d).
For å teste om naturlige edderkoppsilkebelegg geler under forhold som nå er funnet å forårsake geldannelse av de rekombinante edderkopp-proteinene, ble belegg samlet fra den store ampullakjertelen til den svenske broedderkoppen (Larinioides sclopetarius).Belegg ble lagret i 20 mM Tris-HCl-buffer ved 50 mg/ml (basert på målt tørrvekt), men ingen geldannelse ble observert under den 21 dager lange inkubasjonen ved 37 °C (tilleggsfigur 2a).
For å kvantifisere disse gelene, kan reologiske målinger brukes til å studere geleringsprosessen og bestemme de generelle mekaniske egenskapene.Spesielt kan overvåking av lagringsmodulen (elastisiteten) ved forhøyede temperaturer gi informasjon om geleringstemperaturen så vel som de viskoelastiske egenskapene til belegget.Temperaturøkningseksperimenter (ved bruk av 1°C/min ved 25-45°C, basert på tidligere studier med naturlige silkestamløsninger)40,41 viste at lagringsmodulene til His-NT2RepCT og NT-løsninger økte med økende temperatur.ble økt (fig. 2 og tilleggsfig. 3).Spesielt begynte NT-modulen å vokse ved en lavere temperatur sammenlignet med His-NT2RepCT, i samsvar med den raskere geltiden observert når NT ble direkte inkubert med His-NT2RepCT ved 37 ° C (figur 1).Etter et påfølgende temperaturfall gikk ikke lagringsmodulen tilbake til lavere verdier og holdt seg over tapsmodulen (se tilleggsfigur 3), noe som indikerer termisk irreversibel stabil geldannelse.Etter gelering varierte den endelige elastisitetsmodulen fra 15 til 330 kPa for His-NT2RepCT-hydrogeler ved en konsentrasjon på 100–500 mg/mL, og den endelige elastisitetsmodulen for NT-hydrogeler (100–500 mg/mL) varierte fra 2 til 1400 kPa (fig. 2 og fullstendige rampedata) se tilleggsfigur 3).
a Endring i temperatur under målinger av His-NT2RepCT (300 mg/ml) og b NT (300 mg/ml) med risting.Pilene indikerer temperaturtrenden, og den lysere skyggen av lagringsmoduldataene viser testing ved lavere dreiemomentverdier for instrumentet enn spesifisert av produsenten, som er årsaken til den økte støyen.c Sluttmodulakkumulering av His-NT2RepCT og NT etter forhøyet temperatur (100, 300 og 500 mg/ml).Alle modulavlesninger tas med en frekvens på 0,1 Hz.
Som en potensiell metode for å undersøke konformasjonsendringer assosiert med gelering, registrerte vi FTIR-spektra av His-NT2RepCT og NT før og etter gelering ved 37 ° C (figur 3a, b).Som forventet tilsvarte spektrene til His-NT2RepCT- og NT-løsninger proteiner som viste α-helix/random coil sekundær struktur, med et uttalt bånd ved 1645 cm-1.For begge hydrogeler resulterte gelering i dannelsen av to armer i det midtre I-båndet ved ca. 1617 cm-1 og 1695 cm-1 (fig. 3a, b), noe som indikerer dannelsen av antiparallelle β-sheetstrukturer.Disse endringene kan også tydelig sees i det respektive andre derivatet og forskjellsgeleringsspektra (tilleggsfigur 4b).De to båndene i NT β-laget var mer uttalt enn de til His-NT2RepCT, noe som indikerer at det totale innholdet av β-lagsbånd i NT-hydrogelen var høyere enn NT2RepCT-hydrogelen.
et FTIR-absorpsjonsspektra av His-NT2RepCT og b NT (begge 500 mg/ml) før (løsning) og etter (gel) inkubasjon ved 37°C.c TEM-bilder av resuspenderte 50 mg/ml NT2RepCT-geler og d NT.Målestokk 200 nm.e Fiberdiametre av His-NT2RepCT og NT hydrogeler.n = 100 målte fibriller, p < 0,0001.Feillinjene viser standardavviket.Sentrum av feilstrekene er gjennomsnittet.En uparet t-test (two-tailed) ble brukt for statistisk analyse.f ThT-fluorescens av forskjellige rekombinante spidroinproteiner (100 mg/ml) ved 37 °C uten å riste.g NT (100 mg/ml) inokulasjonseksperimenter fra 100 mg/ml NT gel med 0 %, 5 %, 10 % og 20 % frø.
Analyse av gelen ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) viste at hydrogelen består av amyloidlignende fibriller (fig. 3c, 3d).NT-formede fibriller var forlengede (5–12 nm i diameter) og uforgrenede, mens His-NT2RepCT-fibriller var kortere i lengde og betydelig bredere i diameter (7–16 nm) (fig. 3e).Disse resultatene tillot oss å følge kinetikken til fibrose ved å bruke tioflavin T (ThT)-analysen.For alle rekombinante spidroinproteiner økte det fluorescerende signalet når prøvene ble inkubert ved 37 °C (fig. 3f, tilleggsfig. 5a).I samsvar med dette funnet, avslørte mikroskopisk undersøkelse av NT og His-NT2RepCT under geleringsbetingelser en jevn økning i ThT-fluorescens uten merkbar lokal akkumulering av ThT-positive aggregater (tilleggsfigur 5b, c).Dannelsen av ThT-positive fibriller ble ikke ledsaget av en økning i NT- og His-NTCT-turbiditet (Supplerende Fig. 5d), noe som betyr at det kunne dannes et nettverk av fibriller i gelen uten å gå på bekostning av gelens klarhet.Såing ved å tilsette små mengder pre-formede fibriller kan betydelig akselerere fibrildannelse av noen amyloider42,43,44, men tilsetning av 5%, 10% eller 20% (w/w) NT til en løsning av NT hydrokoagulanter.seeding effekt (fig. 3g).Kanskje skyldes dette at fibrillene i hydrogelen er relativt faste og ikke kan brukes som frø.
Den uventede oppførselen til rekombinante spidroinproteiner ved høye temperaturer førte til ytterligere nukleær magnetisk resonans (NMR) spektroskopistudier for å identifisere konformasjonsendringer assosiert med geldannelse.NMR-spektra av His-NT2RepCT-løsninger registrert over tid ved 37°C viste at CT fortsatt var delvis foldet, mens NT- og 2Rep-signaler hadde forsvunnet (fig. 4a), noe som tyder på at det hovedsakelig var NT og 2Rep som delvis kontrollerte dannelsen av His- NT2RepCT hydrogel.CT-signalet ble også dempet til 20 % av dets opprinnelige intensitet, noe som tyder på at CT også stort sett er fiksert og innlemmet i hydrogelstrukturen.For en mindre del av CT, som er like mobil som i den preinkuberte prøven og dermed observert ved løsnings-NMR, mangler spektrene signaler for de første 10 strukturerte restene, muligens på grunn av vanskelig immobilisering av den vedlagte delen av His-NT2Rep.NMR-spektrene til -tilstanden til hydrogeler -NT2RepCT avslørte den dominerende tilstedeværelsen av α-helikser og β-lag og, i mindre grad, den tilfeldige spolekonformasjonen (fig. 4b).Kjemisk skiftanalyse av metioninrester kun tilstede i NT viste at dette domenet hadde blitt omdannet til en β-arkstruktur.De tidsavhengige spektrene til NT i løsning viste en jevn reduksjon i signalintensitet (fig. 4c), og faststoff-NMR av NT-hydrogeler viste at de fleste av NT-restene ble omdannet til β-arkstrukturer (fig. 4d).Konformasjonen til 2Rep kunne ikke bestemmes separat på grunn av dens tendens til å aggregere.Faststoff-NMR-spektrene til NTCT- og His-NT2RepCT-hydrogelene så imidlertid veldig like ut (Fig. 4b; Supplerende Fig. 6b), noe som tyder på at 2Rep bidro lite til den strukturelle delen av His-NT2RepCT-hydrogelen.For CT-hydrogeler ble det funnet a-helikser, β-sheets og tilfeldige spiralformede sekundære strukturer (Supplerende Fig. 6d).Dette antyder at noen deler av CT forblir α-helikser mens andre blir β-sheets.Resultatene av NMR-spektroskopi antyder således at NT er viktig for hydrogeldannelse og også transformeres til en β-arkkonformasjon ved fusjon med 2Rep og CT.I samsvar med dette fant vi nylig at amyloide romlige glidelåser sannsynligvis dannes i alle fem helikser i NT-domenet, og Waltz-algoritmen spådde en amyloidogen region i helix 1 (fig. 4e).
2D-spektra av 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-løsning før (blå) og 19 timer etter inkubering (rød) ved 37°C.Individuelle krysstopper i det røde spekteret og F24, G136, polyA i det blå spekteret er angitt med enkeltbokstavs aminosyresymboler og restnummer.Innsettingene viser avhengigheten av signalintensiteten på tid for utvalgte rester fra NT-, 2Rep- og CT-domenene.b Solid-state radiofrekvens (RFDR) spektra av His-NT2RepCT hydrogeler.Korrelasjoner av Cα/Cβ-rester observert i RFDR-spektra ble bestemt ved sammenligning med kjemiske skift av modellpeptider og verdier avledet fra statistikk82,83 og deres sekundære strukturer.SSB – roterende sidebånd.c Endimensjonale spektre av 15N-HSQC 10 mg/ml NT-løsning under inkubering ved 37 °C i 36 timer.Innsatsen viser volumetrisk intensitet versus tid.d Faststoff-RFDR-spektra av NT-hydrogeler.Korrelasjonene til Cα/Cβ-rester og deres sekundære strukturer observert i RFDR-spektrene er indikert.e Basert på NT45.79-flimmertilbøyelighetsprofilen fra Zipper-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta-energien til det romlige lynskiftvinduet til heksapeptidet er vist i kcal/mol.Røde søyler angir heksapeptider med høy fibrosetilbøyelighet (Rosetta-energi under -23 kcal/mol; under den stiplede linjen).Grønne søyler indikerer fragmenter med Rosetta-energier over terskelen og derfor mindre sannsynlighet for å danne steriske glidelåser.Fragmenter inneholdende prolin ble ekskludert fra analysen (uten kolonner).Firkanter indikerer områder med amyloidose forutsagt av Waltz-algoritmen81 (https://waltz.switchlab.org).Sekvensen av aminosyrerester av NT er øverst, og typene av rester som finnes i β-sekundærstrukturen (bestemt ved faststoff-NMR-spektroskopi) er vist i rødt.Posisjonene til de fem NT a-heliksene er betegnet som (H1-H5)28.
Ved pH <6,5 dimeriserer HT, og er motstandsdyktig mot varme- eller ureaindusert denaturering18.For å belyse hvordan NT-dimerisering og stabilitet påvirker geldannelse, ble løsninger som inneholdt 100 mg/ml NT kontrollert ved pH 8, 7 og 6 ved bruk av hetteglass-inversjonstesten.NT-prøver inkubert ved pH 8 og 7 gelerte etter 30 minutter ved 37 °C, men pH 8-gelen forble klar, mens pH 7-gelen viste et synlig bunnfall (fig. 5a).I motsetning til dette dannet ikke en løsning som inneholdt HT ved pH 6 en gel, og et stort bunnfall kunne sees etter 20 minutter ved 37°C.Dette antyder at dimerer i seg selv og/eller deres høyere stabilitet sammenlignet med monomerer forhindrer geldannelse.Dannelsen av et presipitat for NT ved pH 7 og 6 var ikke forventet, siden det er rapportert at NT er løselig ved 200 mg/ml27, refolder seg lett etter varmedenaturering og beholder også en α-helix ved lavere verdier på pH 18. En sannsynlig forklaring på disse avvikene er at de tidligere rapporterte forsøkene ble utført ved romtemperatur eller under, eller ved relativt lave proteinkonsentrasjoner16,18,19.
NT hetteglass inversjonstest (100 mg/ml) ved pH 8, 7, 6 og 154 mM NaCl (pH 8) etter inkubering ved 37°C.b NT CD-spektra med og uten henholdsvis 154 mM NaF og 154 mM NaCl.Molar elliptisitet ved 222 nm konverteres til en andel naturlige folder.c NT-inversjonsanalyse (100 mg/ml) NT* (37 °C og 60 °C), NTA72R (37 °C) og His-NT-L6 (37 °C og 60 °C).d CD-spektra av NT-mutantene NT*, NTA72R og His-NT-L6.Molar elliptisitet ved 222 nm konverteres til en andel naturlige folder.e Inversjonstest av NTFlSp, NTMiSp og redusert NTMiSp (100 mg/mL).Målestokk 5 mm.f CD-spektra av NT, NTFlSp, NTMiSp og redusert NTMiSp.Molar elliptisitet ved 222 nm konverteres til en andel naturlige folder.Fulle NT-spektre ved 25 °C og 95 °C er vist i tilleggsfigur 8.
Fysiologisk saltkonsentrasjon bestemmer elektrostatiske interaksjoner mellom NT-underenheter og dimerisering av NT-overføring til lavere pH18.Vi fant at tilstedeværelsen av 154 mM NaCl og NaF faktisk inhiberte geldannelse (fig. 5a, b; tilleggsfigur 2b) og at disse saltene økte den termiske stabiliteten til NT-monomerer (fig. 5b, tilleggsfigur 8). .Det antyder også at stabilitetsforbedring, snarere enn dimerisering, forhindrer geldannelse.
For ytterligere å utforske rollen til proteindimerisering og stabilitet i gelering, brukte vi to mutanter, NT* og NTA72R, som også forblir monomere ved lav pH28,30.NT* er en reverseringsmutant med dobbel ladning der den tilsynelatende dipolare ladningsfordelingen til monomeren er flatet ut, noe som forhindrer dimerisering og øker monomerstabiliteten drastisk.NTA72R er en ladet dipol, men Arg-substituert Ala er lokalisert ved dimergrensen, så mutasjoner forstyrrer underenhetsinteraksjoner som kreves for dimerisering.Ved inkubering ved 37°C dannet ikke NT* en hydrogel, mens NTA72R dannet en ugjennomsiktig gel i 15 minutter (fig. 5c).Siden både NT* og NTA72R ikke kan dimerisere, men skiller seg i monomerstabilitet (fig. 5d), antyder disse resultatene sterkt at høy termodynamisk stabilitet hindrer NT i å gelatinere.Dette støttes også av at HT* danner en gel når den er ustabil ved høy temperatur (etter 8 min ved 60°C; Fig. 5c).Det er tidligere vist at det høye innholdet av metionin i NT gjør dens naturlige folding flytende og at seks Met til Leu-erstatninger (her referert til som His-NT-L6) stabiliserer NT46-monomeren sterkt.Basert på antakelsen om at strukturell fleksibilitet er nødvendig for NT-geldannelse, fant vi at den stabile His-NT-L6-mutanten ikke gelerte ved 37 ° C (figur 5c, d).Imidlertid dannet His-NT-L6 også en gel ved inkubering ved 60°C i 60 minutter (fig. 5c).
NTs evne til å transformere seg til β-arkstrukturer og danne hydrogeler ser ut til å gjelde noen, men ikke alle, NT-domenene til spidroin.NT-er fra forskjellige silketyper og edderkopparter, Trichonephila clavipes (NTFlSp), dannet geler til tross for deres relativt lave metionininnhold og høye termiske stabilitet (fig. 5e, f og tilleggstabell 2).I motsetning til dette, dannet ikke NT fra det lille ampulære proteinet spidroin fra Araneus ventricosus (NTMiSp) med lav termisk stabilitet og høyt metionininnhold hydrogeler (tilleggstabell 2 og fig. 5e, f).Sistnevnte kan være assosiert med tilstedeværelsen av intramolekylære disulfidbindinger29,47.Konsekvent, når disulfidbindingene til NTMiSp ble redusert, dannet det en hydrogel etter inkubering ved 37°C i 10 minutter (fig. 5e).Avslutningsvis bør det bemerkes at strukturell fleksibilitet er et viktig, men ikke det eneste, kriteriet for dannelsen av en gel fra NT.En annen faktor som kan være relevant er tilbøyeligheten til å danne amyloidfibriller, og analyse med glidelåsdatabasen og Waltz-algoritmen viste en sammenheng mellom evnen til å danne geler og tilstedeværelsen av amyloidogene regioner, samt omfanget av de predikerte områdene. for å danne steriske glidelåser.Det var en korrelasjon (tilleggstabell 2 og tilleggsfigur 9).
NTs evne til å danne fibriller og danne geler under gunstige forhold førte til at vi antok en hypotese om at NT-fusjoner med andre proteinfragmenter fortsatt kan danne geler med full funksjon av fusjonspartnere.For å teste dette introduserte vi henholdsvis grønt fluorescerende protein (GFP) og purin-nukleosid-fosforylase (PNP) ved C-terminalen av NT.De resulterende fusjonsproteinene ble uttrykt i E. coli med svært høye endelige utbytter (150 mg/L og 256 mg/L ristekolbekulturer for henholdsvis His-NT-GFP og His-NT-PNP), i samsvar med det som er vist for Andre proteiner smeltet til NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) og His-NT-PNP (100 mg/ml) fusjonsproteiner dannet geler etter 2 timer og 6,5 timer ved 37°C og, viktigere, GFP-fraksjonen forble uendret.observert etter gelering, med >70 % av den opprinnelige fluorescensintensiteten igjen etter gelering (fig. 6a).For å måle PNP-aktivitet i his-NT-PNP-løsninger og geler, måtte vi fortynne fusjonsproteinet med NT fordi den enzymatiske aktiviteten til det rene preparatet var utenfor deteksjonsområdet til analysen ved geleringskonsentrasjoner.Gelen dannet med en blanding inneholdende 0,01 mg/ml His-NT-PNP og 100 mg/ml NT beholdt 65 % av den initiale enzymatiske aktiviteten til de preinkuberte prøvene (fig. 6b).Gelen forble intakt under målingen (tilleggsfig. 10).
a Relativ fluorescensintensitet før og etter gelering av His-NT-GFP (300 mg/ml) og omvendt hetteglass som inneholder His-NT-GFP-hydrogel (300 mg/ml) under synlig og UV-lys.Punkter viser individuelle målinger (n = 3), feilsøyler viser standardavvik.Gjennomsnittsverdien vises i midten av feillinjene.b PNP-aktivitet ble oppnådd ved fluorometrisk analyse ved bruk av løsninger og geler bestående av NT (100 mg/ml) og en blanding inneholdende 0,01 mg/ml his-NT-PNP og 100 mg/ml New Taiwan dollar.Innsatsen viser et omvendt hetteglass som inneholder en hydrogel som inneholder His-NT-PNP (5 mm skala bar).
Her rapporterer vi dannelsen av hydrogeler fra NT og andre rekombinante spidroinproteiner ved å inkubere en proteinløsning ved 37 °C (figur 1).Vi viser at geldannelse er assosiert med transformasjon av α-helikser til β-lag og dannelse av amyloidlignende fibriller (fig. 3 og 4).Dette funnet er overraskende ettersom NT-er er kveilede kuleformede fem-helix-bunter kjent for sin ekstremt høye løselighet og høye stabilitet ved konsentrasjoner >200 mg/ml ved 4°C i flere dager27.I tillegg refolder NT-er lett etter varmedenaturering ved lave proteinkonsentrasjoner i µM.Ifølge våre resultater krever fibrilldannelse en kombinasjon av >10 mg/ml proteinkonsentrasjon og lett forhøyet temperatur (fig. 1).Dette er i samsvar med ideen om at amyloidfibriller kan dannes fra globulært foldede proteiner som er i en delvis utfoldet tilstand på grunn av termiske svingninger under fysiologiske forhold 48 .Eksempler på proteiner som gjennomgår denne konverteringen inkluderer insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin og lysozyme51,52,53.Selv om NT er en α-helix i sin opprinnelige tilstand, er omtrent 65 % av polypeptidkjeden kompatibel med sterisk glidelåsdannelse (fig. 4e) 45 .Siden monomeren er dynamisk mobil46, kan den eksponere disse potensielle amyloidogene regionene ved moderat forhøyede temperaturer og ved høye konsentrasjoner av totalt protein kan den nå en kritisk konsentrasjon for dannelse av amyloidfibriller54.Etter dette resonnementet fant vi en negativ korrelasjon mellom spidroinkonsentrasjon og geleringstid (fig. 1c), og hvis den monomere NT-konformasjonen stabiliseres enten ved mutasjoner (NT*, His-NT-L6) eller ved salttilsetning, kan det forhindre at dannelse av hydrogeler (fig. 5).
I de fleste tilfeller forsvinner amyloidfibriller fra løsningen som et bunnfall, men under visse forhold kan de danne hydrogeler55,56,57.Hydrogel-dannende fibriller har vanligvis et høyt sideforhold og danner stabile tredimensjonale nettverk gjennom molekylær sammenfiltring,55,58 i samsvar med resultatene våre.For hydrogeldannelse in vitro foldes proteiner ofte helt eller delvis ut, for eksempel ved eksponering for organiske løsemidler, høy temperatur (70–90°C) og/eller lav pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Spidroin-hydrogelene beskrevet her krever ikke hard behandling, og de krever heller ikke tverrbindingsmidler for å stabilisere hydrogelene.
Det har tidligere blitt rapportert at spidroin-repetisjoner og QD-er, som ser ut til å gjennomgå β-sheet-bytte under silkespinning, danner hydrogeler.Sammenlignet med funnene våre var inkubasjonstider og/eller inkubasjonstemperaturer henholdsvis betydelig lengre eller høyere, og de resulterende hydrogelene var ofte ugjennomsiktige (Figur 7 og tilleggstabell 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. I tillegg til raske geltider, overgikk NT-hydrogeler >300 mg/ml (30 %) alle andre beskrevne rekombinante edderkoppsilkeproteinhydrogeler, så vel som naturlige hydrogeler som gelatin, alginat (2 %), agar (0,5 % ) og kollagen.(0,6%) (Figur 7 og tilleggstabeller 1 og 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Geltiden og elastisitetsmodulen til hydrogelene i denne studien ble sammenlignet med andre spidroinbaserte hydrogeler og utvalgte naturlige hydrogeler.Referanser er gitt sammen med en beskrivelse av geleringsbetingelsene.APS Ammoniumpersulfat, romtemperatur.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Edderkopper ser ut til å ha utviklet måter å forhindre spidroin i å gelere under lagring.Til tross for den høye konsentrasjonen av protein i silkekjertelen, betyr den store repetisjonsregionen assosiert med det terminale domenet at den tilsynelatende konsentrasjonen av NT og CT i kjertelen tilsvarer omtrent 10-20 mg/ml, ved grensen til denne studien.nødvendig for in vitro observert hydrogeldannelse.I tillegg stabiliserte lignende konsentrasjoner av salter 16 NT, som i silkekjertler (fig. 5b).NT-konformasjon har blitt studert i E. coli-cytosol og funnet å være tettere foldet enn ved undersøkelse in vitro, noe som ytterligere indikerer at salt eller andre faktorer hindrer dets aggregering in vivo.Imidlertid kan evnen til NT-er til å transformere til β-sheetfibriller være viktig for filamentdannelse og bør undersøkes i fremtidige studier.
I tillegg til de nye aspektene ved NT-amyloid-lignende fibril og hydrogeldannelse observert i denne studien, viser vi også at dette fenomenet kan ha bioteknologiske og biomedisinske anvendelser (fig. 8).Som et proof of concept kombinerte vi NT med GFP eller PNP og viste at fusjonsproteinet også danner hydrogeler når det inkuberes ved 37 °C og at GFP- og PNP-fraksjonene stort sett beholder sin aktivitet etter gelering (Figur 6).Nukleosidfosforylaser er viktige katalysatorer for syntese av nukleosidanaloger75, noe som gjør oppdagelsen vår relevant for den biofarmasøytiske industrien.Konseptet med å uttrykke fusjonsproteiner som danner transparente hydrogeler under gunstige forhold gjør det mulig å lage funksjonaliserte hydrogeler med gunstige egenskaper for et bredt spekter av bruksområder som enzymimmobilisering, kontrollert medikamentfrigjøring og vevsteknikk.I tillegg er NT og NT* effektive ekspresjonsmarkører30, noe som betyr at NT og dets varianter kan brukes til høykapasitetsproduksjon av løselige fusjonsproteiner og påfølgende dannelse av immobiliserte målproteiner i 3D-hydrogeler.
NT er løselig, α-helikal og stabil ved lave konsentrasjoner (µM) og 37°C.Ved samme temperatur, men ved økende konsentrasjoner (>10 mg/ml), danner NT geler bestående av amyloidlignende fibriller.NT-fusjonsproteiner danner også fibrillære geler med fullt funksjonelle fusjonsfragmenter, slik at forskjellige proteiner kan immobiliseres i 3D-hydrogeler ved bruk av NT.Nederst: NT (PDB: 4FBS) og illustrasjoner av fibernettverk og tilhørende proteinstrukturer (antatt og ikke tegnet i skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ).
Konstruksjonene (se tilleggstabell 4 for en fullstendig liste inkludert aminosyresekvenser) ble klonet inn i plasmid pT7 og transformert inn i E. coli BL21 (DE3).E. coli inneholdende konstruerte plasmider ble inokulert i Luria-buljong supplert med kanamycin (70 mg/l) og dyrket over natten ved 30°C og 250 rpm.Kulturen ble deretter inokulert 1/100 i LB-medium inneholdende kanamycin og dyrket ved 30°C og 110 rpm inntil OD600 nådde 0,8.For NMR-studier ble bakterier dyrket i M9 minimalt medium inneholdende 2 g D-glukose 13C (Aldrich) og 1 g ammoniumklorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) for proteinmerking med isotoper.Senk temperaturen til 20 grader Celsius og induser proteinekspresjon med 0,15 mM isopropyltiogalaktopyranosid (sluttkonsentrasjon).Etter proteinekspresjon over natten ble cellene høstet ved 7278 × g, 4 ° C i 20 minutter.Cellepelleter ble resuspendert i 20 mM Tris-HCl, pH 8, og frosset inntil videre bruk.Tintede celler ble lysert ved bruk av en celleforstyrrer (TS-seriens maskiner, Constant Systems Limited, England) ved 30 kPa.Deretter ble lysatene sentrifugert ved 25 000 g i 30 minutter ved 4°C.For NTMiSp ble pelleten deretter resuspendert i 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, og sonikert i 2 minutter (2 s på/av, 65 %), deretter sentrifugert igjen ved 25 000 xg, 4°C. 30 min.Supernatanten ble satt på en Ni-NTA-kolonne, vasket med 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, og til slutt ble proteinet eluert med 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. For å generere NT2RepCT og NTCT, trombinfordøyelse introduserer stedet (ThrCleav) mellom His og NT.Trombin-spaltningssteder er også til stede i His-NT-ThrCleav-2Rep (produserer 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produserer NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produserer CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produserer NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produserer NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produserer NTF1Sp), og His-Svovelredoksin-ThrCleav-NTMiSp (produserer NTMiSp).Konstruksjonene ble spaltet med trombin (1:1000) og dialysert over natten ved 4°C med 20 mM Tris-HCl, pH 8, ved bruk av en Spectra/Por dialysemembran med en molekylvektsterskel på 6-8 kDa.Etter dialyse fylles løsningen på en Ni-NTA-kolonne og avløpet som inneholder proteinet av interesse, samles opp.Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å måle UV-absorbansen ved 280 nm ved å bruke ekstinksjonskoeffisienten til hvert protein, bortsett fra NTF1Sp, som brukte Bradford-analysen i henhold til produsentens protokoll.Renhet ble bestemt ved SDS polyakrylamid (4–20 %) gelelektroforese og Coomassie brilliant blue farging.Proteiner ble konsentrert ved bruk av sentrifugefiltre (VivaSpin 20, GE Healthcare) ved 4000 xg med en 10 kDa molekylvektsgrense i 20 minutters sykluser.
Tin proteinløsningen og pipetter forsiktig 150 µl inn i et 1 ml klart septum hetteglass (8 x 40 mm Thermo Scientific).Rørene ble lukket og forseglet med parafilm for å forhindre fordampning.Prøver (n = 3) ble inkubert ved 37°C eller 60°C og periodisk invertert for å observere geldannelse.Prøver som ikke gelerte ble inkubert i minst én uke.Reduser NTMiSp disulfidbindinger med 10 mM DTT per 10 µM protein.For å analysere geldannelsen av naturlige edderkoppsilkebelegg ble den svenske broedderkoppen kuttet, de to hovedampullerte kjertlene ble plassert i 200 μl 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 og kuttet for å la belegget skille seg fra kjertlene..Innholdet i kjertlene oppløses i buffer, 50 µl for bestemmelse av tørrvekt (ved inkubering av åpne ampuller ved 60 °C til konstant vekt) og 150 µl for gelering ved 37 °C.
Målegeometrien/verktøyet er laget av rustfritt stål ved hjelp av en parallellplate med en toppdiameter på 20 mm og et gap på 0,5 mm.Varm opp prøven fra 25 °C til 45 °C og tilbake til 25 °C med en hastighet på 1 °C per minutt ved å bruke en Peltier-plate i rustfritt stål.Vibrasjonsmålinger ble utført med en frekvens på 0,1 Hz og i det lineære viskoelastiske området av materialet ved en belastning på 5 % og 0,5 % for prøver på henholdsvis 100 mg/ml og 300–500 mg/ml.Bruk et tilpasset fuktighetskammer for å forhindre fordampning.Data ble analysert med Prism 9.
For å samle infrarøde (IR) spektre ved romtemperatur fra 800 til 3900 cm–1.ATR-enheten, så vel som lysbanen gjennom spektrometeret, renses med tørr filtrert luft før og under eksperimentet.Løsninger (500 mg/ml for å minimere vannabsorpsjonstopper i spektrene) ble pipettert på krystallene, og geler (500 mg/ml) ble dannet før måling og deretter overført til krystallene (n = 3).1000 skanninger ble registrert med en oppløsning på 2 cm-1 og null driftssyklus på 2. Den andre deriverte ble beregnet ved å bruke OPUS (Bruker) ved å bruke et utjevningsområde på ni punkter.Spektrene ble normalisert til samme integrasjonsregion mellom 1720 og 1580 cm-1 ved bruk av F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.I ATR-IR-spektroskopi er penetrasjonsdybden til en infrarød stråle inn i en prøve bølgetallavhengig, noe som resulterer i sterkere absorpsjon ved lavere bølgetall enn ved høyere bølgetall.Disse effektene er ikke blitt korrigert for spektrene vist i fig.3 fordi de er veldig små (tilleggsfig. 4).Korrigerte spektra for denne figuren ble beregnet ved bruk av Bruker OPUS-programvaren.
I prinsippet er en omfattende kvantifisering av proteinkonformasjoner mulig etter pålitelig dekonvolvering av komponentene innenfor amid I-toppen.Det oppstår imidlertid noen hindringer i praksis.Støy i spekteret kan vises som (falske) topper under dekonvolusjon.I tillegg faller toppen på grunn av vannbøyning sammen med posisjonen til amid I-toppen og kan ha en lignende størrelse for prøver som inneholder en stor mengde vann, slik som den vandige gelen som er studert her.Derfor forsøkte vi ikke å dekomponere amid I-toppen fullstendig, og våre observasjoner bør kun vurderes til støtte for andre metoder som NMR-spektroskopi.
Løsninger på 50 mg/ml NT og His-NT2RepCT ble gelert over natten ved 37°C.Hydrogelen ble deretter fortynnet med 20 mM Tris-HCl (pH 8) til en konsentrasjon på 12,5 mg/ml, ristet godt og pipettert for å bryte gelen.Deretter ble hydrogelen fortynnet 10 ganger med 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl av prøven ble påført et kobbergitter belagt med formvar, og overskuddsprøven ble fjernet med tøypapir.Prøver ble vasket to ganger med 5 µl MilliQ-vann og farget med 1 % uranylformiat i 5 minutter.Fjern overflødig flekk med absorberende papir, og lufttørk deretter nettet.Avbildning ble utført på disse rutenettene ved å bruke en FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN som opererer ved 100 kV.Bildene ble tatt opp med x 26 500 og x 43 000 forstørrelser ved bruk av et Veleta 2k × 2k CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Tyskland).For hver prøve (n = 1) ble det tatt opp 10–15 bilder.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ble brukt til bildeanalyse og måling av fiberdiametre (n = 100, forskjellige fibre).Prisme 9 ble brukt til å utføre uparrede t-tester (two-tailed).Gjennomsnittlige His-NT2RepCT- og NT-fibriller var henholdsvis 11,43 (SD 2,035) og 7,67 (SD 1,389) nm.Konfidensintervallet (95 %) er -4,246 til -3,275.frihetsgrader = 198, p < 0,0001.
80 µl væskeprøver inneholdende 10 µM tioflavin T (ThT) ble målt i tre eksemplarer (n = 3) under statiske forhold ved bruk av Corning 96-brønners svartbunnede klare bunnplater (Corning Glass 3881, USA).Fluorescensforskjeller ble registrert ved bruk av et 440 nm eksitasjonsfilter og et 480 nm emisjonsfilter (FLUOSTar Galaxy fra BMG Labtech, Offenburg, Tyskland).ThT-signalet ble verken mettet eller slukket, da eksperimenter med forskjellige konsentrasjoner av ThT ble utført uten å endre signalintensiteten.Registrer absorbans ved 360 nm for uklarhetsmåling.For såingseksperimenter ble 100 mg/ml geler dannet ved 37°C, resuspendert og brukt til såing ved molforhold på 5 %, 10 % og 20 %.Data ble analysert med Prism 9.
Tin lager av His-NT2RepCT og NT >100 mg/ml på is og filtrer gjennom et 0,22 µm filter.Konsentrasjoner ble beregnet ved å måle absorbans ved 280 nm ved bruk av Nanodrop.I brønner på en 96-brønners sort ikke-bindende plate (Corning) med klar bunn ble prøvene fortynnet til 20 mg/ml i 20 mM Tris-HCl pH 8 og blandet med 5 μM ThT (sluttkonsentrasjon), total prøvekonsentrasjon 50 μl volum.Prøver ble avbildet hvert 10. minutt ved 37 °C på et CellObserver (Zeiss) mikroskop med transmittert lyskanal og FITC eksitasjons- og emisjonsfiltersett for ThT-avbildning.Et 20x/0,4-objektiv brukes til bildebehandling.Zen Blue (Zeiss) og ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ble brukt til bildeanalyse.Geler ble også fremstilt fra NT- og His-NT2RepCT-løsninger i en konsentrasjon på 50 mg/ml inneholdende 20 mM Tris pH 8 og 5 µM ThT og inkubert ved 37°C i 90 minutter.Gelbitene ble overført til en ny brønn som inneholdt 20 mM Tris, pH 8 og 5 μM ThT i en ikke-bindende svart 96 brønns klar bunnplate.Skaff grønn fluorescens og lyse feltbilder ved 20x/0,4 forstørrelse.ImageJ ble brukt til bildeanalyse.
Løsnings-NMR-spektra ble oppnådd ved 310 K på et 600 MHz Bruker Avance Neo-spektrometer utstyrt med en QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-prøver som inneholder 10 mg/ml homogent protein merket med 13C, 15N, oppløst i 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (vekt/volum) NaN3, 5 % DO (volum/volum), (n = 1) .Kjemiske skift av NT2RepCT ved pH 6,7 ble brukt for å tildele topp 23 i 2D-spekteret til 15N-HSQC.
Magisk vinkel-spinnende solid NMR (MAS)-spektra av 13C, 15N-merkede hydrogeler ble registrert på et Bruker Avance III HD-spektrometer ved 800 MHz utstyrt med en 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronløs sonde.Prøvetemperaturen ble kontrollert ved bruk av en gasstrøm med variabel temperatur ved 277 K. Todimensjonal dipolrotasjonsresonans (DARR)76 og radiofrekvensgjenkobling (RFDR)77-spektra ble innhentet ved MAS-frekvenser på henholdsvis 12,5 kHz og 20 kHz.Krysspolarisering (CP) fra 1H til 13C ble utført ved bruk av en lineær rampe fra 60,0 til 48,0 kHz ved 1H, 61,3/71,6 kHz ved 13C (ved 12,5/20 kHz MAS) og kontakttid 0,5–1 ms.Spinal6478-avkobling ved 73,5 kHz ble brukt under datainnsamling.Innsamlingstiden var 10 millisekunder og syklusforsinkelsen var 2,5 sekunder.De enkeltkoblede Cα/Cβ-korrelasjonene som ble observert i RFDR-spektrene ble tildelt basert på de karakteristiske kjemiske skiftene av resttype og multippelkoblede korrelasjoner i DARR-spektrene.
Zipper79-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ble brukt til å evaluere flutter-tendenser og Rosetta-energi for NT, NTFlSp og NTMiSp.Zipper-databasen beregner Rosetta Energy80, som kombinerer flere gratis energifunksjoner for å modellere og analysere proteinstruktur.Et energinivå på -23 kcal/mol eller lavere indikerer høy tendens til flimmer.Den lavere energien betyr mer stabilitet av de to β-trådene i glidelåskonformasjonen.I tillegg ble Waltz-algoritmen brukt til å forutsi amyloidogene regioner i NT, NTFlSp og NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT-proteinløsningen ble blandet med 2-(N-morfolino)etansulfonsyre (MES) buffer ved pH 5,5 og 6,0 for å senke pH til henholdsvis pH 6 og 7.Den endelige proteinkonsentrasjonen var 100 mg/ml.
Målinger ble utført på et J-1500 CD-spektrometer (JASCO, USA) ved bruk av en 300 μL kyvette med en optisk bane på 0,1 cm.Proteiner ble fortynnet til 10 μM (n = 1) i 20 mM fosfatbuffer (pH 8).For å analysere proteinstabilitet i nærvær av salt, ble proteiner analysert i samme konsentrasjon (n = 1) i 20 mM fosfatbuffer (pH 8) inneholdende henholdsvis 154 mM NaF eller NaCl.Temperaturskanninger ble registrert ved 222 nm fra 25°C til 95°C med en oppvarmingshastighet på 1°C/min.Andelen av naturlig foldede proteiner ble beregnet ved å bruke formelen (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).I tillegg ble fem spektre registrert for hver prøve fra 260 nm til 190 nm ved 25°C og etter oppvarming til 95°C.Fem spektre ble gjennomsnittsberegnet, jevnet ut og konvertert til molar elliptisitet.Data ble analysert med Prism 9.
Fluorescensintensiteten til His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) ble målt i tre eksemplarer (n = 3) i 96-brønners Corning-plater med svart gjennomsiktig bunn (Corning Glass 3881, USA) under statiske forhold.Mål prøver med en fluorescensbasert plateleser med en eksitasjonsbølgelengde på 395 nm og registrer emisjonen ved 509 nm før gelering og 2 timer senere ved 37 °C.Data ble analysert med Prism 9.
Purin-nukleosid-fosforylaseaktivitetsanalysesett (fluorometrisk metode, Sigma Aldrich) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner.For å måle aktivitet i geler og løsninger som inneholder His-NT-PNP, bland 10 ng His-NT-PNP med 100 mg/ml NT til et totalt volum på 2 µL fordi gelen ga et signal over deteksjonsintervallet til settet.Kontroller for geler og løsninger uten His-NT-PNP ble inkludert.Målingene ble utført to ganger (n = 2).Etter at aktiviteten var målt, ble reaksjonsblandingen fjernet og gelen fotografert for å sikre at gelen forble intakt under målingen.Data ble analysert med Prism 9.
For mer informasjon om studiedesign, se Nature study abstract koblet til denne artikkelen.
Figurene 1 og 2 viser de første dataene.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f og 6, tilleggsfigurer.3, supplerende fig.5a, d, supplerende fig.6 og tilleggsfig.8. Data Data fra denne studien er vert i Zenodo-databasen https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR-dataene oppnådd i denne studien ble lagt ut til BMRBig-depotet under oppførings-ID bmrbig36.Strukturene til GFP og PNP ble hentet fra PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. og Johansson, J. Spinning av kunstig edderkoppsilke.National Chemical.biologi.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes-genomet fremhever mangfoldet av gener fra edderkoppsilke og deres komplekse uttrykk.Nasjonal Genette.49, 895–903 (2017).