ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks sveiset rør for kjemisk industri kjemisk komponent, Mangel på SPECC1L fører til økt stabilitet av skjøte ledd og redusert utskillelse av kraniale nevrale kamceller.

Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleks sveiset rør for kjemisk industri

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.er en ledende produsent som er spesialisert på sømløse rør i rustfritt stål, lyse glødede rør, sømløse kveilrør etc.For å lette kundene har vi også sveiset rør og rør.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.har det mest avanserte produksjons- og testutstyret.Vi kan fullt ut tilfredsstille dine krav.I henhold til standarden har rør som produseres av oss alltid korrekt OD og WT toleranse.Toleransekontrollen er strengt i samsvar med produksjonsstandardene.Våre produkter er alltid fornøyd med kundene.Kunder som kjøpte produktene våre skapte mer fortjeneste.
a) OD (ytre diameter): 3,18 mm til 101,6 mm
b) WT (veggtykkelse): 0,5 mm til 20 mm
c) Lengde: I henhold til kundens krav
d) Standarder: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 osv
e) Prosessmetode: ERW, EFW etc

Skyveknapper som viser tre artikler per lysbilde.Bruk tilbake- og neste-knappene for å gå gjennom lysbildene, eller lysbildekontrollknappene på slutten for å gå gjennom hvert lysbilde.
De kraniale nevrale kamcellene (CNCC) slynges av de embryonale nevrale foldene og migrerer til svelgbuene, som danner de fleste av strukturene i midten av ansiktet.CNCC-dysfunksjon spiller en viktig rolle i etiologien til orofacial spalte, en vanlig medfødt misdannelse.Heterozygote SPECC1L-mutasjoner er funnet hos pasienter med atypiske og syndromiske spalter.Her rapporterer vi forbedret farging av kanoniske adhesive junction (AJ) komponenter, β-catenin og E-cadherin i dyrkede SPECC1L knockdown-celler, og elektronmikrografer viser apikal-basal diffusjon av AJ.For å forstå rollen til SPECC1L i kraniofacial morfogenese, laget vi en Specc1l-mangelfull musemodell.Homozygote mutanter er embryonale dødelige og viser nedsatt nevralrørslukking og CNCC-laminering.AJ-proteinfarging er økt i mutante nevrale folder.Denne AJ-defekten er i samsvar med en defekt i CNCC-delaminering, som krever AJ-oppløsning.I tillegg har Specc11-mutanter redusert PI3K-AKT-signalering og økt apoptose.In vitro var mild hemming av PI3K-AKT-signalering i villtypeceller tilstrekkelig til å indusere AJ-endringer.Viktigere, AJ-endringer indusert av SPECC1L knockdown kan reverseres ved aktivering av PI3K-AKT-banen.Til sammen antyder disse dataene at SPECC1L, som en ny regulator av PI3K-AKT-signalering og AJ-biologi, er nødvendig for nevralrørslukking og CNCC-stratifisering.
Kraniale nevrale kamceller (CNCCs) lokaliserer seg til den dorsale nevroektodermen og løsner fra nevroepitelet til de utviklende nevrale foldene gjennom en prosess som involverer epitel-mesenkymal overgang (EMT)1,2,3.Premigrerende epiteliale CNCCer forstyrrer intercellulære kryss og blir migrerende mesenkymale CNCCer som fyller den første og andre svelgbuen og danner det meste av kraniofacialbrusken.Dermed blir gener som regulerer CNCC-funksjonen ofte forstyrret i etiologien til kraniofasiale medfødte anomalier som orofaciale kløfter, som oftest påvirker 1/800 fødsler i USA alene.En av de medfødte misdannelsene8.
Delaminering av CNCC faller sammen med lukkingen av det fremre nevralrøret mellom 8,5 og 9,5 dager med embryonal utvikling hos mus.Mutanter av en rekke mus orofaciale spalte-assosierte gener viser også en form for nevrale rørdefekt, inkludert Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 og Pdgfrα12.Imidlertid kan prosessene med nevralrørslukking og CNCC-stratifisering betraktes som uavhengige, da Splotch-mutantmusen (Pax3) viser defekter i nevralrørslukking uten noen effekt på CNCC-stratifisering eller migrasjon 13,14.Ytterligere musemodeller med defekter i CNCC-disseksjon og nevralrørslukking vil bidra til å avgrense det felles molekylære grunnlaget for disse to prosessene.
Isolering av CNCC fra nevroepitelceller krever oppløsning av adhesive junctions (AJs), som er sammensatt av proteinkomplekser som inneholder blant annet E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin og α-actinin assosiert med aktinfilamenter 2 Overekspresjonsstudier E-cadherin i nevrale folder viste en reduksjon eller forsinkelse i CNCC-delaminering.Motsatt resulterer undertrykkelse av E-cadherin i tidlig stratifisering15,16.Mange av faktorene som medierer EMT under CNCC-stratifisering er transkripsjonsfaktorer (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) og ekstracellulær matrise (ECM) remodelleringsproteiner som matrisemetalloproteinaser (MMPs), men CNCCer er direkte cytoskjelett-AJ-regulatorer ennå ikke kjent.PI3K-AKT-veien er kjent for å motvirke E-cadherin-nivåer, hovedsakelig fra kreftforskning17.Nyere studier har vist at tap av PDGFα-basert PI3K-AKT-signalering hos mus fører til kraniofasiale abnormiteter, inkludert ganespalte og nevralrørsdefekter12.Imidlertid er forholdet mellom PI3K-AKT-banen og AJ-stabilitet ved CNCC-stratifisering uklart.
Vi har tidligere identifisert SPECC1L som det første mutante genet hos to personer med en alvorlig spalte som strekker seg fra munnen til øyet, kjent som oblique cleft (ObFC) eller Tessier IV18 cleft.SPECC1L-mutasjoner er identifisert i to multigenerasjonsfamilier med autosomalt dominant Opitz G/BBB-syndrom (OMIM #145410), der berørte individer viste hyperdistanse og leppe/ganespalte19, og i en familie med Tibi-overdistansesyndrom (OMIM #145420)20 .mer enn halvparten av tilfellene av Opitz G/BBB-syndrom er X-koblet (OMIM #300000) og er forårsaket av mutasjoner i MID1-genet, som koder for protein 22 i det mikrotubuli-assosierte celleskjelettet.Vi antar at SPECC1L, også et protein assosiert med mikrotubuli og aktincytoskjelettet, kan formidle signalering som kreves for ombygging av aktincytoskjelett under celleadhesjon og migrasjon 18 .Gjennom in vitro- og in vivo-studier beskriver vi nå SPECC1L som en ny regulator av AJ-stabilitet gjennom PI3K-AKT-signalering.På cellenivå resulterte SPECC1L-mangel i en reduksjon i nivået av pan-AKT-proteinet og en økning i den apikale-basale dispersjonen av AJ, som ble eliminert ved kjemisk aktivering av AKT-banen.In vivo viser Specc11-mangelfulle embryoer nedsatt nevralrørslukking og redusert CNCC-disseksjon.Dermed fungerer SPECC1L i sterkt regulert celleadhesjonsbasert signalering som kreves for normal CNCC-funksjon under ansiktsmorfogenese.
For å karakterisere rollen til SPECC1L på cellenivå, brukte vi den tidligere beskrevne stabile osteosarkomcellelinjen U2OS som mangler SPECC1L18.Disse stabile U2OS-cellene med SPECC1L (kd) knockdown hadde en moderat (60–70 %) reduksjon i nivåene av SPECC1L-transkripter og proteiner, sammen med defekter i migrasjon og reorganisering av aktincytoskjelettet 18. I motsetning til dette, en alvorlig forbigående reduksjon i SPECC1L har vist seg å føre til mitotiske defekter 23 .Etter ytterligere karakterisering fant vi at våre stabile SPECC1L-kd-celler endret morfologi ved en veldig høy grad av konfluens (figur 1).Individuelle kontrollceller og kd-celler ved lav konfluens så like ut (figur 1A, D).24 timer etter fusjon beholdt kontrollcellene sin kubiske form (fig. 1B, E), mens SPECC1L-kd-celler ble forlenget (fig. 1C, F).Omfanget av denne endringen i celleform ble fanget ved in vivo levende avbildning av kontrollceller og kd-celler (film 1).For å bestemme rollen til SPECC1L i konfluente celler, undersøkte vi først uttrykket.Vi fant at SPECC1L-proteinnivåer økte ved fusjon (Figur 1G), mens SPECC1L-transkripsjonsnivåer ikke økte (Figur 1H).I tillegg, etter hvert som celletettheten økte, akkumulerte SPECC1L-proteinet ved intercellulære grenser (fig. 2A-E), med et mønster som overlapper mønsteret til membranassosiert β-catenin (fig. 2A'-E').Gitt assosiasjonen av SPECC1L med aktincytoskjelettet 18,23 antok vi at SPECC1L interagerer med aktinbaserte adhesive junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) celler forlenges ved høy konfluens (F) sammenlignet med kontroll U2OS celler (AC).Her vises tre av de seks tidspunktene (T1, T3, T6) som vi valgte for forskjellige celletettheter.(G) Western blot-analyse som viser at SPECC1L-proteinet er stabilisert ved en høy grad av konfluens sammenlignet med en lav grad av konfluens i kontrollceller.Western blot av SPECC1L viser det forventede 120 kDa-båndet og et bånd med høyere molekylvekt, muligens post-translasjonelt modifisert (*).Western blot-analyse ble utført under de samme forholdene for lav og høy konfluens.Bilder som viser SPECC1L ved lav og høy konfluens ble tatt fra samme blot.Den samme blotten ble fjernet og undersøkt på nytt med β-aktin-antistoff.(H) Kvantitativ RT-PCR-analyse viste ingen signifikante endringer i SPECC1L-transkriptnivåer.Feilstreker representerer SEM-er fra fire uavhengige eksperimenter.
(AE) Vi valgte seks tidspunkter (T1-T6) som representerer en rekke celletettheter for å normalisere celleformanalyse og AJ-endringer i U2OS-celler med SPECC1L knockdown (kd).De første fem av disse tidspunktene inkluderte enkeltceller (T1), 50-70 % fusjon av små celleklynger (T2), fusjon uten omforming av kd-celler (T3), omforming av kd-celler (T4) og 24-timers endringer.i bakre form av kd (T5) celler.SPECC1L-proteinet ble hovedsakelig spredt i cytoplasmaet ved T1 (A), men dets akkumulering ble observert ved intercellulære grenser ved påfølgende tidspunkt (B–E, piler).(FJ) β-catenin viser lignende akkumulering ved intercellulære grenser assosiert med AJ-komplekset.(A'-E') SPECC1L og β-catenin viser overlappende farging ved cellegrenser ved høy celletetthet (piler).(F'-J') I SPECC1L-kd-celler virker β-catenin-farging normal ved lav celletetthet (F'-H'), men utvides når celleformen endres (I', J'; piler), noe som indikerer at AJ har forandret.Barer = 10 µm.
Vi prøvde deretter å bestemme effekten av SPECC1L-mangel på AJ.Vi brukte flere AJ-assosierte markører, inkludert de kanoniske komponentene F-aktin, myosin IIb, β-catenin og E-cadherin24,25,26,27.Aktin-stressfibre økte i SPECC1L-kd-celler som beskrevet tidligere (fig. 3A,B) 18.Myosin IIb assosiert med aktinfilamenter viste en lignende økning i SPECC1L-kd-celler in vitro (fig. 3C, D).AJ-assosiert β-catenin binder seg til cadherin ved cellemembranen, og viser et normalt "honeycomb" uttrykksmønster i kontrollkubocytter (fig. 3E,G).Interessant nok, i flate bilder ved bruk av konfokal mikroskopi, viste β-catenin (Fig. 3E,F) og E-cadherin (Fig. 3G,H) farging på cellemembranen til sammenflytende SPECC1L-mangelfulle celler fremtredende mønstre av utvidet farging.Denne utvidelsen av AJ-assosiert β-catenin-farging i kd-celler var mest uttalt ved konfluens, men så ut til å gå foran endringer i celleform (fig. 2F-J, F'-J').For å bestemme den fysiske naturen til denne utvidede AJ-fargingen, undersøkte vi cellegrenser på den apikale-basale overflaten til SPECC1L-kd U2OS-celler ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) (Figur 3I, J).I motsetning til kontrollceller (fig. 3I), som hadde separate elektrontette områder som indikerer AJ (piler), viste kd-celler (fig. 3J) store, sammenhengende områder med høy elektrontetthet som indikerer AJ langs det apikobasale planet..I tillegg, på tverrsnitt, observerte vi omfattende cellemembranfolder i kd-celler (fig. S1A, B), som forklarer det utvidede mønsteret av β-catenin og E-cadherin-fargebånd (fig. 3F, H).Til støtte for rollen til SPECC1L i AJs, ble β-catenin co-immunopresipitert med SPECC1L i lysater av konfluente U2OS-celler (fig. 3K).Sammen med utvidet immunfarging for AJ-markører, var TEM-analyse i samsvar med vår hypotese om at SPECC1L-mangel øker AJ apikal-basal tetthet og varians.
(AH) Økt F-aktin-farging i kd-celler 48 timer etter fusjon (T6; A, B).Endret farging av myosin IIb assosiert med F-aktin (C, D).Det glatte mønsteret av β-catenin og E-cadherin membranfarging i kontrollceller (E, G) ble forbedret i SPECC1L-kd (F, H) celler.Barer = 10 µm.(I–J) Elektronmikrografer som observerer det apikale-basale intercellulære krysset.Kontrollceller viser distinkte elektrontette regioner som indikerer klebrige veikryss (I, piler).I motsetning til dette så hele den apikale-basale krysset i SPECC1L-kd-celler ut som elektrontett (J, piler), noe som indikerer økt tetthet og spredning av klebende kryss.(K) β-catenin ble co-immunutfelt med SPECC1L i konfluente U2OS-cellelysater.Bilde tatt fra ett sted som representerer ett av fire uavhengige eksperimenter.
For å forstå rollen til SPECC1L i kraniofacial morfogenese, opprettet vi en Specc1l-mangelfull musemodell ved å bruke to uavhengige ES-fellecellelinjer, DTM096 og RRH048 (BayGenomics, CA), som representerer intron 1 og Specc1l-transkripter ble fanget ved 15 (fig. 1). .4A, figur S2).Den genomiske plasseringen av lokkevektorinnskuddet ble bestemt ved helgenomsekvensering og bekreftet ved PCR (fig. S2).Begge genfelle-designene tillot også fusjon i rammen av Specc11-lacZ-reporterne ved fangst.Derfor ble lacZ-ekspresjon bestemt ved X-gal-farging brukt som en indikator på Specc11-ekspresjon.Begge allelene viste lignende lacZ-ekspresjonsmønstre, med DTM096-genfellen i intron 1 som viste sterkere uttrykk enn RRH048 i intron 15 (ikke vist).Imidlertid er Specc1l vidt uttrykt, med spesielt sterkt uttrykk i nevrale folder ved E8.5 (Figur 4B), i nevralrøret og ansiktsprosesser ved E9.5 og E10.5 (Figur 4C,D), og i lemmer under utvikling ved E10.5 og øyne (Figur 4D).Vi har tidligere rapportert at SPECC1L-ekspresjon i den første svelgbuen ved E10.5 var til stede i epitelet og underliggende mesenchyme18, i samsvar med CNCC-avstamningen.For å teste SPECC1L-uttrykk i CNCC, utførte vi E8.5 nevrale folder (Figur 4E-J) og E9.5 hodeskallesnitt (Figur 4K-).Ved E8.5 farget SPECC1L nevrale folder intenst (fig. 4E, H), inkludert celler farget med NCC-markører (fig. 4G, J).Ved E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) sterkt farget migrerende CNCC co-farget med AP2A (Fig. 4L, M) eller SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Skjematisk representasjon av muse Specc11-genet som viser lokkevektorinnsetting i ES DTM096 (intron 1) og RRH048 (intron 15) cellekloner.(BD) lacZ-farging av heterozygote Specc1lDTM096-embryoer som representerer Specc1l-ekspresjon fra E8.5 til E10.5.NE = nevroectoderm, NF = nevralfold, PA1 = første svelgbue.(EP) SPECC1L-immunfarging med NCC-markører AP2A og SOX10 i E8.5 (NF; EJ) nevrale folder og E9.5 (KP) hodeskallesnitt.SPECC1L-farging ble mye observert i nevrale folder E8.5 (E, H; pilspisser), inkludert celler merket med AP2A (F, G; pilspisser) og SOX10 (I, J; pilspisser).Ved E9.5 farget SPECC1L sterkt migrerende CNCCer (K, N; piler) merket AP2A (L, M; piler) og SOX10 (O, P; piler).
Kryssing mellom heterozygote Specc1lDTM096/+ og Specc1lRRH048/+ mus viser at de to genfelle-allelene ikke er komplementære og at sammensatte heterozygoter og embryonale homozygoter for begge genfelle-allelene er embryonale dødelige (tabell S1).Mendelske forhold indikerte en reduksjon i overlevelsesraten for heterozygoter ved fødselen (forventet 1,34 vs. 2,0).Vi bemerket lav perinatal dødelighet blant heterozygoter, noen hadde kraniofasiale anomalier (fig. S3).Imidlertid gjør den lave penetransen til disse perinatale kraniofaciale fenotypene det vanskelig å studere deres underliggende patofysiologiske mekanismer.Derfor fokuserte vi på den embryonale dødelige fenotypen til homozygote Specc11-mutanter.
De fleste sammensatte heterozygote eller homozygote Specc1lDTM096/RRH048 mutante embryoer utviklet seg ikke etter E9.5–10.5 (fig. 5A–D), og nevralrøret lukket ikke anteriort (fig. 5B, D) og noen ganger lukket bakover (ikke vist) ..Denne kraniale nevralrørslukkingsdefekten var assosiert med at flertallet av CNCC-merket DLX2 ble igjen i nevrale folder ved E10.5, noe som indikerer ingen disseksjon (figur 5A'-D').For å avgjøre om den totale størrelsen på CNCC også ble redusert, merket vi CNCC-linjer med GFP i genfellelinjene våre med Wnt1-Cre og ROSAmTmG.Vi streamer sortert GFP+ NCC og GFP- (RFP+) ikke-NCC fra hele embryoer.Ved E9.5 endret ikke andelen strømningssorterte GFP-merkede CNCCer seg signifikant mellom WT og mutante embryoer (ikke vist), noe som indikerer normal CNCC-spesifikasjon.Derfor antok vi at gjenværende Wnt1-Cre- og DLX2-farging i eksponerte nevrale folder (Figur 5B') skyldtes defekt CNCC-lag, muligens på grunn av økt tetthet eller spredning av AJ-celler, som sett i SPECC1L-kd-celler.Vi brukte NCC-markørene SOX10, AP2A og DLX2 for å bekrefte tilstedeværelsen av CNCC i nevrale folden (Figur 5E-R).Ved E8.5 ble nevrale foldfarging for alle tre NCC-markører observert i seksjoner av WT (fig. 5E, G, I) og Specc1l-mutant (fig. 5F, H, J).Ved E9.5, mens NCC-markører farget migrerende NCC i WT-seksjoner (Fig. 5M, O, Q), ble gjenværende NCC-farging observert i eksponerte nevrale folder av Specc1l mutante embryoer (Fig. 5N, P, R).Fordi SOX10 og DLX2 markerer migrerende CNCC-er, antyder dette resultatet at SPECC1L-mangelfulle CNCC-er oppnår spesifikasjoner etter migrasjon, men ikke klarer å migrere fra nevrale folder.
Specc11-mangel fører til defekt nevralrørslukking, delaminering av kraniale nevrale kamceller og AJ-er.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryobærende migrerende kraniale nevrale kamceller (CNCC) merket med Wnt1-Cre (A').I kontrast viser Specc11 mutante embryoer åpne nevrale folder (B), pilspisser) og CNCCer som ikke har migrert (B', pilspisser).(C, D') Lysfeltbilder (C, D') og immunfarging (C', D') av CNCC-markøren DLX2 av E10.5 WT-embryoer (C, C') og Specc1l (D, D').I WT E10.5-embryoer koloniserer DLX2-positive CNCC gjellebuene (C', piler), mens i mutanter vedvarer iøynefallende farging i de åpne nevrale foldene (D', piler) og i de første svelgbuene (D', piler).) med noe farging (piler) som indikerer dårlig delaminering og migrering av CNCC.ER) Snitt av WT- og Specc1l-mutante embryoer i trinn E8.5 (E–L) og E9.5 (M–R) ble merket med NCC-markører SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) og DLX2 (I, J, Q, R).Ved E8.5 ble NCC-farging observert i villtype neuralfold (NF) og mutante seksjoner.Samfarging av SOX10 og β-catenin i E8.5 WT (K) og mutant (L) avslørte økt β-catenin-farging ved cellegrenser i nevrale folder.Ved E9.5 ble villtypefarging av migrerende CNCC-er (M, O, Q) observert, mens ustratifiserte CNCC-er i mutanter farget åpne nevrale folder (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ-merkingsanalyse i koronale seksjoner av WT- og Specc11DTM096/RRH048-embryoer med E9.5-mutasjonen.Et omtrentlig snittplan er vist i øvre høyre hjørne.I seksjoner av mutant vev ble det observert økt farging av F-aktin (S, T) og myosin IIb (U, V).I likhet med in vitro-resultatene i fig. 3, i mutante embryoer, ble forbedret membranfarging for β-catenin (W, X) og E-cadherin (Y, Z) observert.(AA-BB) Et elektronmikrofotografi av et utsnitt av et villtype-embryo som ser utover grensen til den apikale-basale cellen viser en distinkt elektrontett region som indikerer adhesive kryss (AA, piler).I motsetning til dette, i seksjoner av Specc11 mutante embryoer (BB, piler), er hele apikobasale krysset elektrontett, noe som indikerer en økt tetthet og spredning av adhesive kryss.
For å teste hypotesen vår om at redusert lagdeling skyldes endret AJ, undersøkte vi AJ-merking i eksponerte nevrale folder av Specc1l mutante embryoer (fig. 5S-Z).Vi observerte en økning i aktin-stressfibre (fig. 5S, T) og en samtidig økt lokalisering av myosin IIB-farging på aktinfibre (fig. 5U, V).Viktigere, vi observerte økt farging av β-catenin (Fig. 5W, X) og E-cadherin (Fig. 5Y, Z) ved intercellulære grenser.Vi undersøkte også β-catenin-farging av NCC i nevrale folder av E8.5-embryoer (fig. 5K, L).β-catenin-farging så ut til å være sterkere i Specc1l mutante nevrale folder (fig. 5L og K), noe som tyder på at AJ-endringer hadde begynt.I elektronmikrofotografier av hodeskallseksjoner av E9.5-embryoer, observerte vi igjen økt diffus elektrontett farging i Specc1l-mutante embryoer sammenlignet med WT (fig. 5AA, BB og S1E-H).Til sammen støtter disse resultatene våre in vitro-resultater i SPECC1L-kd U2OS-celler og antyder at avvikende AJ-farging går foran CNCC-stratifisering i våre mutante embryoer.
Gitt det kjente antagonistiske forholdet mellom AKT-aktivitet og E-cadherin-stabilitet,17,28 antok vi involvering av PI3K-AKT-signalering.I tillegg observerte vi subepidermal blemmer i noen av våre mutante embryoer som slapp dødelighet (<5%) ved E9.5-10.5 og i stedet slo seg ned på rundt E13.5 (fig. S3).Subepidermale vesikler er et kjennetegn på redusert PI3K-AKT-signalering basert på PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapporterte at forstyrrelse av PDGFRα-basert PI3K-aktivering i PdgfraPI3K/PI3K-mutante embryoer resulterer i subepidermale vesikler, nevralrørsdefekter og fenotyper av ganespalte.Faktisk ble nivåer av pan-AKT og aktivt fosforylert Ser473-AKT redusert in vivo i Specc1l mutant vev til E9.5 embryonal arrestasjon (fig. 6A-D).Nedgangen i nivåer av fosforylert Ser473-AKT kan helt og holdent skyldes reduksjonen i nivåer av pan-AKT in vivo (FIG. 6E) og in vitro (FIG. 6F).En in vitro-reduksjon ble observert bare når U2OS-celler var sterkt konfluente med endringer i celleform og AJ-tetthet (figur 6D).Dermed tyder våre data på at SPECC1L er en ny positiv regulator av PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenese.
(A–E) E8.5 (A,B) og E9.5 (C,D) skalleseksjoner eller E9.5 lysater fra Specc1l mutante embryoer (E) som viser nivåer av aktivt fosforylert S473-AKT og pan-AKT Proteinreduksjon , sammenlignet med kontroll WT.Western blotting ble utført på villtype lysater og mutante lysater under de samme forholdene.Bildene vist for SPECC1L ble tatt fra en blot.Den samme blotten ble fjernet og undersøkt på nytt med anti-pan-ACT og β-aktin antistoffer.Pan-AKT-nivåer i E8.5-nevrale folder (A, B) og nivåer av fosforylert S473-AKT i E9.5-hodeskalleseksjoner ble betydelig redusert.(F) Pan-AKT-nivåer ble tilsvarende redusert i lysater av SPECC1L-kd U2OS-celler høstet ved høy konfluens.Feilstreker representerer SEM-er fra tre uavhengige Western blot-kvantifiseringer.(GJ) Snitt av WT-embryoer ved E9.5 farget med henholdsvis KI67 og spaltet caspase 3, som viser celleproliferasjon (G, G') og liten apoptotisk aktivitet (H, H').Specc11 mutante embryoer viser sammenlignbar celleproliferasjon (I), men antallet celler som gjennomgår apoptose er betydelig økt (J).
Vi undersøkte deretter markører for spredning og apoptose.Vi observerte ingen forskjell i proliferasjonen av E9.5-embryoer (fig. 6E, G sammenlignet med I) med en proliferasjonsindeks på 82,5 % for WT-mutanter og 86,5 % for Specc1l-mutanter målt ved KI67-farging (p <0,56, Fisher's eksakt test).Tilsvarende observerte vi ingen forskjell i apoptose målt ved farging for spaltet caspase 3 i nevrale folder ved E8.5 inntil embryoarrest (ikke vist) (ikke vist).Derimot ble apoptose betydelig økt i alle E9.5 mutante embryoer (fig. 6F, H og J).Denne generelle økningen i apoptose er i samsvar med redusert PI3K-AKT-signalering og tidlig embryonal dødelighet29,30,31.
Deretter, for å bekrefte en årsaksrolle for PI3K-AKT-signalering i AJ-endringer i våre kd-celler, endret vi kjemisk veien i kontroll- og kd-celler (figur 7A-F).Vi brukte som markør celleformendringens fenotype observert i konfluente SPECC1L-kd-celler, som vi kvantifiserte ved å bruke forholdet mellom den lengste dimensjonen (lengden) og den tilsvarende vertikale dimensjonen (bredden).Et forhold på 1 forventes for relativt runde eller kubiske celler (figur 7G).I tillegg til celleform, bekreftet vi også effekten på AJ ved β-catenin-farging (fig. 7A'-F').Inhibering av PI3K-AKT-veien ved bruk av wortmannin var tilstrekkelig til å endre celleform i kontrollceller (figur 7A, C) og AJ (figur 7A').PI3K-AKT-aktivator SC-79 påvirket ikke celleform (FIG. 7A, E) eller AJ-ekspansjon (FIG. 7A') i kontrollceller.I SPECC1L-kd-celler resulterte ytterligere undertrykkelse av PI3K-AKT-veien i økt apoptose (fig. 7B, D) og en markert økning i β-catenin-farging (fig. 7B'), i samsvar med våre tunge mutanter in vivo.Viktigere, aktivering av PI3K-AKT-banen forbedret celleformen (Figur 7B, F) og AJ-fenotyper (Figur 7B") betydelig.Endringer i celleform ble kvantifisert som cellerundhetsforhold (CCR) og sammenlignet for signifikans som beskrevet ovenfor (FIG. 7G).Faktisk, i kontrollceller (fig. 7G, CCR = 1,56), var wortmanninbehandling tilstrekkelig til å endre celleformen signifikant (fig. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) i en grad lik den observerte i SPECC1L.-kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,46).Wortmanninbehandling av SPECC1L-kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,60, neglisjerbar) var ikke mer signifikant enn ubehandlede kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,46, ubetydelig) eller wortmanninbehandlede kontrollceller (fig. 7G)., CCR = 3,46, ubetydelig) påvirker i tillegg celleforlengelse (7G, CCR = 3,61, ubetydelig).Viktigst, SC-79 AKT-aktivator gjenopprettet den langstrakte fenotypen til SPECC1L-kd-celler (fig. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Disse resultatene bekrefter at SPECC1L regulerer PI3K-AKT-signalering og antyder at en moderat reduksjon i SPECC1L påvirker celleadhesjonen, mens en sterk reduksjon fører til apoptose (fig. 8).
(A–F') Kontroll (A, C, E) og SPECC1L-kd (B, D, F) celler behandlet med PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) eller SC-79 aktivator (E, F) behandling .Ubehandlede kontrollceller er kubiske (A) med normal β-cat cellulær farging (A'), mens kd-celler er forlengede (B) med økt β-cat-farging (B').Etter undertrykkelse av PI3K-AKT-banen, ble kontrollcellene forlenget (C) med β-cat-ekspansjon (C'), mens kd-celler begynte å gjennomgå apoptose (D), lik våre svært muterte embryoer og viste ekstremt forbedret β-cat.farging (D').Etter aktivering av PI3K-AKT-veien forble kontrollcellene kuboidale (E) og hadde normal β-cat (E')-farging, mens kd-celler viste signifikant forbedret celleform (F) og β-cat (F')-farging, noe som indikerer (G) Graden av celleformendring i (AF) ble kvantifisert ved å bruke cellerundhetsforholdet (CCR) for den lengste dimensjonen (lengde) og den tilsvarende vertikale dimensjonen (bredde) ved bruk av MetaMorph-programvaren.Ubehandlede (NT) SPECC1L-kd-celler (CCR = 3,46) var signifikant lengre enn kontrollceller (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Worts hemming av PI3K-AKT-veien i kontrollceller var tilstrekkelig til å forårsake en lignende forlengelse i celleform (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Tilsvarende gjenopprettet AKT-aktivering av SC-79 i SPECC1L-kd-celler celleforlengelse til kontrollnivåer (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Wortmanninbehandling av SPECC1L-kd-celler resulterte i økt apoptose, men ingen ytterligere økning i celleformendring (CCR=3,60) sammenlignet med ubehandlede kd (CCR=3,46, ns) eller wortmannin-behandlede kontrollceller (3,61) observert i .ns = spiller ingen rolle.+/- SEM-målinger for 50 celler er vist.Statistiske forskjeller ble beregnet ved hjelp av Students t-test.
(A) Skjematisk representasjon av hemming og aktivering av PI3K-AKT-banen som resulterer i henholdsvis AJ-endringer og redning.(B) Foreslått modell for AKT-proteinstabilisering ved SPECC1L.
Premigratoriske CNCC-er krever AJ-lyse for å skille fra fremre nevrale fold-nevroepitelceller1,15,32.Økt farging av AJ-komponenter og tap av den apikale-basale AJ asymmetriske distribusjonen i SPECC1L-mangelfulle celler både in vitro og in vivo, kombinert med den fysiske nærheten av SPECC1L til β-catenin, antyder at SPECC1L fungerer for å opprettholde AJ lokal stabilitet for riktig organisasjonsmuskler.aktin cytoskjelett.Assosiasjonen av SPECC1L med aktincytoskjelettet og β-catenin og økningen i antall kondenserte aktinfilamenter i fravær av SPECC1L er i samsvar med den observerte økningen i AJ-tetthet.En annen mulighet er at et økt antall aktinfibre i SPECC1L-mangelfulle celler fører til en endring i intercellulær spenning.Fordi cellulær stress påvirker AJ 33-dynamikken, kan spenningsendringer resultere i mer diffus AJ 34.Så eventuelle endringer vil påvirke CNCC-lagene.
Wnt1 uttrykkes i de tidlige nevrale foldene som gir opphav til nevrale kamceller.Dermed markerer Wnt1-cre avstamningssporing både pre- og migrerende NCC35.Imidlertid markerer Wnt1 også dorsal hjernevev kloner også avledet fra tidlige nevrale folder 35,36, noe som gjør det sannsynlig at vår farging av E9.5 mutanter for Wnt1 markører i åpne nevrale folder ikke er CNCC.Vår positive farging for NCC-markørene AP2A og SOX10 bekreftet at de eksponerte nevrale foldene til Specc11-mutante embryoer faktisk inneholdt CNCC.I tillegg, siden AP2A og SOX10 er markører for tidlig migrerende NCC, indikerte positiv farging at disse cellene er postmigrerende CNCC som ikke kan stratifiseres av E9.5.
Dataene våre antyder at molekylær regulering av AJ av SPECC1L er mediert av PI3K-AKT-signalering.AKT-signalering er redusert i SPECC1L-mangelfulle celler og vev.Funn av Fantauzzo et al.støtte en direkte rolle for PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenese.(2014) viste at mangelen på aktivering av PDGFRα-basert PI3K-AKT-signalering fører til en ganespalt-fenotype.Vi viser også at hemming av PI3K-AKT-banen er tilstrekkelig til å endre AJ og celleform i U2OS-celler.I samsvar med våre funn, Cain et al.37 viste at nedregulering av PI3K α110-underenheten i endotelceller resulterer i en lignende økning i pericellulær β-catenin-farging, referert til som en økning i "tilkoblingsindeksen".Imidlertid, i endotelceller hvis aktinfilamenter allerede er svært organisert, resulterer undertrykkelse av PI3K-AKT-banen i en løs celleform.I kontrast viste SPECC1L-kd U2OS-celler en langstrakt celleform.Denne forskjellen kan være celletypespesifikk.Mens undertrykkelse av PI3K-AKT-signalering permanent påvirker aktincytoskjelettet, bestemmes effekten på celleform av endringer i spenning forårsaket av endringer i tettheten og organiseringen av sentrale aktinfibre.I U2OS-celler brukte vi bare celleformendringer som en markør for SPECC1L-mangelfull AJ-endring og gjenoppretting.Avslutningsvis antar vi at hemming av AKT-banen i SPECC1L-mangel øker AJ-stabiliteten og reduserer delaminering i CNCC.
Interessant nok ble pan-AKT-nivåer redusert in vitro og in vivo i tillegg til fosforylerte 473-AKT-nivåer i fravær av SPECC1L, noe som tyder på regulering av PI3K-AKT-signalering på nivået av AKT-proteinstabilitet eller omsetning.SPECC1L- og MID1-genene, begge assosiert med Opitz/GBBB-syndrom, koder for proteiner som stabiliserer mikrotubuli 18,22.Mekanismen som SPECC1L og MID1 medierer mikrotubulistabilisering med er ikke fullt ut forstått.I tilfelle av SPECC1L inkluderer denne stabiliseringen forbedret acetylering av en undergruppe av mikrotubuli 18.Det er mulig at SPECC1L bruker en lignende mekanisme for å stabilisere andre proteiner som AKT.Det er vist at acetylering av lysinrester i AKT-proteinet fører til en reduksjon i membranlokalisering og fosforylering38.I tillegg kreves ubiquitinering av K63-kjeden ved samme lysinrest på AKT for dens membranlokalisering og aktivering39,40.Blant flere faktorer som interagerer med SPECC1L-proteiner identifisert i forskjellige to-hybrid-skjermer med høy gjennomstrømning av gjær, har fire – CCDC841, ECM2942, APC og UBE2I43 – blitt implisert i proteinomsetning eller stabilitet via ubiquitinering eller sumoylering.SPECC1L kan være involvert i post-translasjonell modifikasjon av AKT-lysinrester, noe som påvirker AKT-stabiliteten.Imidlertid gjenstår den kritiske rollen til SPECC1L i lokaliseringen og stabiliteten til AKT-proteinet å bli belyst.
Alvorlige defekter i SPECC1L-ekspresjon in vivo resulterte i økt AJ-markørfarging og defekt CNCC-overlegg, samt økt apoptose og tidlig embryonal dødelighet.Tidligere rapporter har vist at musemutanter med økte nivåer av apoptose er assosiert med nevralrørsdefekter 44,45,46,47 og kraniofaciale defekter48.Det har blitt antydet at overdreven celledød i nevrale folder eller svelgbuer kan resultere i et utilstrekkelig antall celler som kreves for riktig morfogenetisk bevegelse 48,49,50.Derimot viste våre SPECC1L-mangelfulle cellelinjer med moderat redusert SPECC1L-ekspresjon bare AJ-endringer uten bevis på økt celledød.Kjemisk hemming av PI3K-AKT-veien i disse Kd-cellene resulterte imidlertid i økt apoptose.Dermed sikrer en moderat reduksjon i SPECC1L-ekspresjon eller funksjon celleoverlevelse.Dette samsvarer med observasjonen om at sjeldne Specc11-mutante embryoer som slipper unna arrestasjon ved st.E9.5 – kanskje på grunn av redusert genfangsteffektivitet – er i stand til å lukke nevrale rør og stoppe senere i utviklingen, ofte med kraniofaciale defekter (fig. S3).I samsvar med dette er også den sjeldne forekomsten av heterozygote Specc1l-embryoer med kraniofaciale abnormiteter – sannsynligvis på grunn av økt effektivitet i genfangst – samt funnet hos sebrafisk der en av de to SPECC1L-ortologene (specc1lb) forårsaker sen embryonale fenotyper, inkludert tap av underkjever og bilaterale kløfter51.Dermed kan heterozygote SPECC1L-tap-av-funksjonsmutasjoner identifisert hos menneskelige pasienter forårsake små svekkelser i SPECC1L-funksjonen under kraniofacial morfogenese, tilstrekkelig til å forklare deres orofaciale spalter.SPECC1L-basert regulering av intercellulære kontakter kan også spille en rolle i palatogenese og fusjon av svelgbuene.Ytterligere studier av SPECC1L-funksjonen vil bidra til å belyse rollen til midlertidige intercellulære kontakter i CNCC under nevralrørslukking i nevroepitelcellemotilitet og kraniofacial morfogenese.
U2OS osteosarkomkontroll og SPECC1L-kd-celler har blitt beskrevet tidligere (Saadi et al., 2011).Antistoffer mot SPECC1L er også blitt karakterisert tidligere (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antistoffer (kanin; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mus; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), spaltet caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) og β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble brukt som beskrevet..Aktinfilamenter ble farget med Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-kontrollceller og SPECC1L-kd-celler ble dyrket i standard høyglukose-DMEM supplert med 10 % føtalt bovint serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).For AJ-endringer ble 2 x 105 celler sådd på glass behandlet med 0,1 % svinegelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og observert for endringer i celleform.Celler ble samlet på forskjellige angitte tidspunkter: 4 timer etter såing (t = 1), 24 timer etter såing (t = 2), sammenløp uten endring i celleform (t = 3), endring i celleform (t = 4) , 24 timer etter celleformendring (t = 5) og 48 timer etter celleformendring (t = 6) (fig. 1, 2, 3).For å modulere PI3K-AKT-veien, ble celler dyrket i de angitte konsentrasjonene med PI3K-AKT-hemmeren wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) eller SC-79-aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Mediet som inneholdt kjemikaliene ble skiftet daglig.
Ramme-for-bilde-opptak ble gjort på levende kontroll- og KD-celler under normale kulturforhold, og fasekontrastbilder ble samlet inn hvert 10. minutt i 7 dager.Bilder ble tatt med et datastyrt Leica DM IRB invertert mikroskop utstyrt med en mekanisk scene og et 10 × N-PLAN objektiv koblet til et QImaging Retiga-SRV-kamera.Under avbildning ble cellekulturer holdt ved 37°C i en fuktig atmosfære med 5 % CO2.
To genfelle ES-cellelinjer DTM096 og RRH048 fra Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ble brukt til å generere Specc11-mangelfulle muselinjer, betegnet Specc1lgtDTM096 og Specc1lgtRRH046.Kort fortalt ble 129/REJ ES-celler injisert i C57BL6-blastocyster.De resulterende kimære hannmusene ble avlet med hunn C57BL6 mus for å identifisere avkom med agouti pelsfarge.Tilstedeværelsen av genfellevektorinnskudd ble brukt for å identifisere heterozygoter.Mus ble holdt på en blandet bakgrunn av 129/REJ;C57BL6.Plasseringen av innsettingsstedet til den genetiske fellevektoren ble bekreftet ved RT-PCR, genomsekvensering og genetisk komplementering (tilleggsfigur 1).For å spore CNCC-avstamningen til doble heterozygote Specc1lGT-mus, ble ROSAmTmG (#007576) og Wnt1-Cre (#003829) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) krysset for å produsere ROSAmTmG- og Wnt1-Cres1ol-allelen i Specclyol-embrcyol.Alle eksperimenter med mus ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Kansas Medical Center.
Embryoer ble fiksert i (1 % formaldehyd, 0,2 % glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) i 60 minutter ved romtemperatur.Etter fiksering i X-gal-fargeløsning (5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl2, 0,01% natriumdeoksycholat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) ble fargeutviklingen utført ved 37°C .°C innen 1-6 timer.Embryoer ble postfiksert i 4% PFA og visualisert.
For Western blotting ble celler lysert i passiv lyseringsbuffer (Promega, Fitchburg, WI) supplert med en blanding av HALT-proteaseinhibitorer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysater ble behandlet på 12% polyakrylamid Mini-PROTEAN TGX ferdige geler (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til Immobilon PVDF-membraner (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranene ble blokkert i 5 % melk i PBS inneholdende 0,1 % Tween.Antistoffer ble inkubert over natten ved 4°C eller i én time ved romtemperatur.Femto SuperSignal West ECL-reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) ble brukt til signalgenerering.For immunfarging ble embryoene fiksert over natten i 4% PFA/PBS og kryokonservert.Vevskryoseksjoner ble blokkert i PBS som inneholdt 1 % normalt geiteserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) og 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og deretter inkubert ved 4°C i en inkubator under natt.med anti-antistoff og fluorescerende sekundært antistoff (1:1000) i 1 time ved 4°C.Fargede seksjoner ble plassert i ProLong gullmedium (Thermo Scientific, Waltham MA) og flate bilder ble oppnådd ved bruk av et Leica TCS SPE konfokalmikroskop.Hver immunfarging ble utført som tre uavhengige eksperimenter på tverrsnitt av minst to mutante embryoer.Et representativt eksperiment vises.
Celler ble inkubert i modifisert RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glyserol, 2 mM EDTA og HALT-proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Kort fortalt ble lysater forhåndsrenset med protein G magnetiske perler (Life Technologies, Carlsbad, CA) og deretter inkubert over natten ved 4 ° C. med anti-SPECC1L eller IgG protein G proteinkuler ble brukt til å ekstrahere SPECC1L og Western blotting ble utført ved bruk av anti-SPECC1L eller IgG protein. -β-catenin antistoff beskrevet ovenfor. Co-IP eksperimentene vist er representative for fire uavhengige eksperimenter.
Fikserte dyrkede celler eller embryonale musevev ble levert til elektronmikroskopisenteret ved University of Kansas Medical Center.Kort fortalt ble prøver innebygd i EMbed 812-harpiks (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerisert over natten ved 60°C og seksjonert ved 80 nm ved bruk av en Leica UC7 ultramikrotom utstyrt med et diamantblad.Snitt ble visualisert ved bruk av et JEOL JEM-1400 transmisjonselektronmikroskop utstyrt med en 100 kV Lab6-pistol.
Hvordan sitere denne artikkelen: Wilson, NR et al.Mangel på SPECC1L fører til økt stabilitet av skjøte ledd og redusert delaminering av kraniale nevrale kamceller.vitenskapen.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksjon og differensiering av nevrale kam.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kraniale nevrale kamceller i bevegelse: deres rolle i kraniofacial utvikling.American Journal of Medical Genetics.Del A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopati: dens vekst og utvikling over 20 år.Barnelege.patologi.laboratorium.medisin.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU og Noten MM Gjennombrudd i genetikken til orofaciale kløfter.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. og Riley, FM Molekulære mekanismer for migrasjon og mønster av kraniale nevrale kamceller under kraniofacial utvikling.Utvikling 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH og Murray, JK Leppe- og ganespalte: forstå genetiske og miljømessige påvirkninger.naturlig kommentar.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Unormal morfogenese av hud, lemmer og kraniofaciale region hos interferonregulerende faktor-6 (Irf6)-mangelfulle mus.Nasjonal Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominante mutasjoner i GRHL3 forårsaker van der Waord syndrom og svekker utviklingen av oral periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ og Juriloff, DM Oppdater listen over musemutanter med defekter i nevralrørslukking og fremgang mot en fullstendig genetisk forståelse av nevralrørslukking.Utredning av fødselsskader.Del A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediert PDGFRalpha-signalering regulerer overlevelse og spredning i skjelettutvikling gjennom en p53-avhengig intracellulær vei.Genutvikling 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND og Murdoch, JN Disheveled: Forholdet mellom konvergent ekspansjon og nevralrørslukking.Trender innen nevrologi.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).