347 rustfritt stål kveilrør kjemisk komponent, identifikasjon av nye interferon-responsive humane leukocytt-antigen-A (HLA-A) chaperoneproteiner ved bruk av kryssbundet massespektrometri (CLMS)

Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Skyveknapper som viser tre artikler per lysbilde.Bruk tilbake- og neste-knappene for å gå gjennom lysbildene, eller lysbildekontrollknappene på slutten for å gå gjennom hvert lysbilde.

produktbeskrivelse

Rustfritt stål 347L spiralrør, stålkvalitet: SS347L

Interferonsignalsystemet induserer en sterk cytokinrespons på et bredt spekter av patogene og iboende patologiske signaler fra miljøet, noe som resulterer i induksjon av undergrupper av interferon-induserbare proteiner.Vi brukte DSS-mediert cross-link massespektrometri (CLMS) for å oppdage nye protein-protein-interaksjoner i domenet til interferon-induserte proteiner.I tillegg til de forventede interferon-induserbare proteinene, identifiserte vi også nye intermolekylære og intramolekylære tverrbundne addukter av kanoniske interferon-induserbare proteiner som MX1, USP18, OAS3 og STAT1.Vi fokuserte på ortogonal validering av et nytt sett med interferon-induserbare proteinnettverk dannet av HLA-A-proteiner (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ved bruk av co-immunopresipitering og deres videre studie ved bruk av molekylær dynamikkmodellering.Modellering av konformasjonsdynamikken til proteinkomplekset avslørte flere interaksjonssteder som reflekterte interaksjonene identifisert i CLMS-funnene.Sammen presenterer vi en pilotstudie av CLMS for å identifisere nye signalkomplekser indusert av interferon, og ser frem til den bredere bruken av CLMS for å identifisere ny dynamikk av proteininteraksjoner i tumormikromiljøet.
Før en adaptiv immunrespons begynner, monterer vertens medfødte forsvarssystem en antimikrobiell respons mediert av en familie av utskilte alfa-helikale cytokiner kalt interferoner (IFN).Type I IFN-klassene IFNα og IFNβ aktiverer cellulære responser, inkludert antivirale, proapoptotiske, proinflammatoriske og antiproliferative tilstander.Hos mennesker er 13 undertyper av IFNα kjent, alle gruppert på kromosom 91. Overraskende nok er det bare IFNα2 som er studert for klinisk bruk.Nylig har det blitt gitt spesiell oppmerksomhet til forskning på andre undertyper av IFNa.En fersk studie viste at IFNα14 er en av de mest effektive isoformene for å begrense HBV2- og HIV-13,4-replikasjon sammenlignet med den kanoniske IFNa2-subtypen.
Det er fastslått at aktiverte type I interferonreseptorkomplekser (IFNAR1 og IFNAR2) utløser en signaltransduksjonskaskade mediert av Janus-kinasene TYK2 og JAK15,6.Disse Janus-kinasene fosforylerer signaltransdusere og transkripsjonelle proteinaktivatorer (STAT1 og STAT2) på tyrosinrester for å starte SH2-domenemediert heterodimerisering6.Deretter binder IRF9 STAT-heterodimerer for å danne et trimerisk kompleks av det IFN-stimulerte faktor 3-genet (ISGF3), som translokerer til kjernen og induserer transkripsjon av over 2000 interferon-stimulerte gener (ISGs)5,6,7,8.
ISG-er danner ryggraden i det medfødte immunsystemet, spesielt som respons på viralt angrep.Som en første forsvarslinje mot virusinfeksjon, distribuerer celler raskt omfattende interaksjoner av cellulære proteiner med et bredt spekter av biologiske aktiviteter.Disse proteinene inkluderer mønstergjenkjenningsreseptorer, signalmolekyler, transkripsjonsfaktorer og proteiner med direkte antivirale funksjoner, samt negative regulatorer av immunrespons9.Mye av informasjonen om ISG-aktivitet kommer fra funksjonelle skjermer som bruker overekspresjonsskjermer10,11 eller gendempingsteknikker (siRNA, RNAi og CRISPR)12,13 der individuelle ISG-er uttrykkes eller hemmes og deres aktivitet testes på ulike virus.Selv om disse studiene har bestemt de antivirale egenskapene til individuelle ISG-er, forblir de underliggende molekylære mekanismene til hver ISG stort sett ukjente.Det er generelt akseptert at mange proteiner interagerer med ett eller flere cytokiner for å sikre full aktivitet, så enten ISG-er samhandler direkte eller deres interaksjoner formidles av cellulære proteiner.For eksempel identifiserte en nylig fotokryssbundet proteomikkstudie ATPase VCP/p97 som en viktig IFITM3-interaksjonspartner, hvis hemming fører til defekter i lysosomal sortering, omsetning og samtransport av IFITM3 med virale partikler 14 .Ved å bruke immunutfelling identifiserte vi VAPA, et vesikkelassosiert protein, som en interaksjonspartner med IFITM1/2/3 som medierer kolesterolmediert viral modning, og dette ble bekreftet av en annen studie ved bruk av et to-hybrid gjærsystem.Vitenskapelig støtte 15 , 16 .
En grunnleggende biologisk prosess involvert i undertrykkelse av infeksjon og ondartet transformasjon er antigenpresentasjon, som formidles av major histocompatibility complex (MHC) molekyler.Peptider (8-12 aminosyrer lange) fra spaltede, for tidlig terminerte eller feilfoldede proteiner blir lastet inn i MHC-I heterodimeren (bestående av MHC-I tunge og lette kjeder, kalt β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.De resulterende stabile MHC-I-trimerene transporteres til celleoverflaten, hvor de presenterer intracellulære peptider til CD8+ T-celler (cytotoksiske T-celler)17.T-celler gjenkjenner og ødelegger disse patogenene og celler som bærer et tumorspesifikt antigen.Følgelig undertrykker patogener og tumorceller ofte antigenpresentasjonsprosessen for å unngå immunovervåking.I tillegg er MHC-I nedregulert i 40-90 % av humane svulster og er ofte assosiert med dårligere prognose19.
Gener som er involvert i å reagere på patogener må raskt bytte mellom en hviletilstand og en tilstand av aktiv transkripsjon.Derfor er flere cellulære proteiner antatt å være involvert i responsen på høy IFN-etterspørsel over korte tidsperioder, inkludert ombygging og modifisering av promoterkromatin 20,21.De fleste studier har fokusert på identifisering av individuelle ISG-proteinpartnere i nærvær av IFN.Flere proteomiske og transkriptomiske studier i modellcellesystemer har belyst effekten av IFN på det cellulære landskapet.Til tross for en økende forståelse av dynamikken indusert av interferoner, vet vi fortsatt lite om involvering av ISG-er.Når man vurderer kompleksiteten og den tidsavhengige dynamikken til interferonsignalering, oppstår to spørsmål: (i) er det mulig å stabilisere og fange multiproteinkompleksene involvert i rask signalering, og (ii) kan disse interaksjonene kartlegges i 3D-rom?
For å løse disse problemene implementerte vi disuccinimid-suberat-mediert kjemisk kryssbinding (DSS) kombinert med massespektrometri (CLMS) for å studere det IFNa-induserte proteininteraksjonsnettverket og dets dynamikk.DSS legger til kovalente bindinger mellom proksimale rester av proteiner og/eller proteinkomplekser in vivo.Påfølgende MS-analyse avslører spesifikke tverrbindingssteder som gjenspeiler den romlige nærheten til regioner innenfor et bestemt protein, kalt interne koblinger, eller underenheter i proteinkomplekser, kalt interrelasjoner.Ved å bruke denne tilnærmingen har vi identifisert flere nye protein-proteinkomplekser så vel som interferoninduserte multiprotein-interaksjonsnettverk.Ved ytterligere å teste en undergruppe av disse nye interaksjonene, demonstrerer vi at H2BFS (H2B histon-type FS; heretter referert til som H2B) og MDN1 fungerer som bindende partnere for HLA-A.
Flo-1-celler er en av de mest kjente in vitro-modellene av esophageal adenokarsinom, da de etterligner nøkkeltrekk ved esophageal tumors22,23.Imidlertid er ikke alle svulster immunogene, og for å avgjøre om Flo-1-celler reagerer på interferonbehandling, behandlet vi Flo-1-celler med 10 ng/ml IFNa i 72 timer.Flo-1-celler viste tidlig induksjon av pSTAT1 og IRF1, startet 2 timer etter behandling og fortsatte i 72 timer, med en tidsavhengig reduksjon i stasjonære nivåer av IRF1 (figur 1A).ISG-er (MX1, IFITM1, OAS1/2 og ISG15) ble funnet å være sterkt indusert etter 6 timer, og etterligner de klassiske mid- og senfaseresponsene på IFNa (figur 1A).Sammen antyder disse dataene at denne cellulære modellen kan brukes til å studere interferonresponser.
Differensielle proteinekspresjonsresponser i Flo-1-celler etter IFNa-behandling.(A) Proteinekspresjon i Flo-1-celler behandlet med 10 ng/ml IFNa i 2, 6, 24, 48 og 72 timer ble analysert ved immunoblot ved bruk av de angitte ISG-antistoffene.(B) Coomassie blåfargede SDS-PAGE geler av helcelleekstrakter etter kryssbinding med DSS for angitte tider og konsentrasjoner.(C) Representativ immunoblot undersøkt med p53(DO-1) antistoff fra de samme prøvene for å vurdere graden av proteinkryssbinding.
For å fange in situ proteininteraksjonslandskapet brukte vi DSS, et mye brukt tverrbindingsmiddel på grunn av dets høye membranpermeabilitet og relativt korte reaksjonstid.Den kortere reaksjonstiden bidrar til å forhindre dannelsen av store aggregater av tverrbundne proteiner, og opprettholder derved stabiliteten til tverrbinderen.For å bestemme den optimale DSS-konsentrasjonen og unngå overtverrbinding, eksponerte vi først cellene for 5, 2,5 og 1 mM DSS i henholdsvis 5, 10, 5 og 30 minutter, og analyserte lysatene med Coomassie-farget SDS-PAGE (data ikke vist) .Cellelysater ser ut til å være sterkt tverrbundet ved den laveste konsentrasjonen og på det korteste tidspunktet.Derfor ble DSS titrert til 1, 0,5 og 0,1 mM over 5 minutter (figur 1B).Optimal tverrbinding ble observert med 0,5 mM DSS i 5 minutter, og disse forholdene ble valgt for celler behandlet med IFNa.I tillegg viser figur 1C en Western blot utført ved bruk av p53 (DO-1) antistoffet for å vurdere graden av proteinkryssbinding.
Flo-1-celler ble behandlet med 10 ng/ml IFNa i 24 timer før tilsetning av tverrbinderen.Tverrbundne celler ble deretter lysert ved to-trinns proteolyse og proteiner ble behandlet av FASP (fig. 2)24,25.Tverrbundne tryptiske peptider ble analysert ved massespektrometri (fig. 2).MS/MS-spektrene blir deretter matchet til proteinsekvensen og kvantifisert med MaxQuant26,27.Tverrbundne peptider ble identifisert fra de oppnådde spektrene ved bruk av SIM-XL-programmet, og individuelle forbindelser ble kombinert til et komplekst nettverk ved bruk av xQuest28 og SIM-XL29 åpen kildekode databehandlingsprogramvare pipelines (fig. 2).SIM-XL identifiserer protein-protein-interaksjoner, interne kjeder og individuelle kjeder i enkle eller komplekse proteinblandinger og gir skript for å visualisere interaksjoner i proteinstrukturer.I tillegg rangerer den hver kryssreferanse som en ID-score i henhold til MS/MS29-spektrumkvaliteten.Flere svært pålitelige protein-protein-interaksjoner og komplekser er identifisert, og et nytt sett med interaksjoner har blitt undersøkt videre ved bruk av ko-immunutfelling og konformasjonsendringer av komplekser ved bruk av molekylær dynamikk (MD)-modellering (fig. 2) 30, 31.
Skjematisk oversikt over CLMS-metoden.Flo-1-celler ble behandlet med 10 ng/ml IFNa i 24 timer etterfulgt av in situ protein-tverrbinding ved bruk av DSS etterfulgt av cellelyse og trypsinisering.Tverrbundne prøver ble analysert ved hjelp av et Orbitrap massespektrometer og ytterligere samplet for fragmentering av peptidforløpere under LC-MS/MS.To koblede peptider ble identifisert fra de oppnådde spektrene ved bruk av Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL)-programmet, og alle forbindelsene ble kombinert til et komplekst nettverk ved hjelp av beregningsrørledninger.Filtrer ut lavkonfidensinteraksjoner basert på falske positive rater (FDR).Flere nye high-fidelity protein-protein-interaksjoner ble ytterligere bekreftet ved bruk av ko-immunutfelling, og konformasjonsendringer i kompleksene ble undersøkt ved bruk av molekylær dynamikk (MD)-modellering.
Totalt ~30.500 og ~28.500 peptider ble påvist ved bruk av MaxQuant i henholdsvis ustimulerte og stimulerte IFNa-prøver (tilleggstabell S1, fig. 3A).Peptidlengdefordelingen i begge tilfeller viste en høyere andel større peptider, noe som indikerer tilstedeværelsen av tverrbundne peptider (fig. 3B,C).I tillegg var en større andel større peptider tilstede i 40–55-området i IFNa-behandlede prøver (fig. 3C).Proteinkartlegging mot log2-intensitet viste at klassiske interferon-stimulerte proteiner var de mest tallrike sammenlignet med ubehandlede prøver, inkludert MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 og HLA-F (Figur 3D).Analyse av veier for proteiner mer enn tre ganger anriket som respons på IFNa-behandling ved bruk av Reactome-banedatabasen viste at MHC-I-mediert antigenpresentasjon og prosessering var den mest dominerende veien (figur 3E).I samsvar med tidligere rapporter var antivirale responser mediert av OAS og ISG15 samt IFNα/β og cytokinsignalering blant de aktiverte veiene.I tillegg ble lysin- og serinspesifikke proteinkryssbindinger identifisert fra de opprinnelig ervervede MS/MS-spektrene ved bruk av SIM-XL.En fersk studie rapporterte 104 ISG-er som spenner over 20 virus fra 9 virusklasser ved meta-analyse av individuelle ISG-overekspresjonsstudier i 5 celletyper9.For å overvinne de beregningsmessige begrensningene ved screening av store datasett, startet vi imidlertid med et mindre datasett for å utforske mulige interaksjoner mellom listen over IRDS-gener rapportert av Padaria et al., hvorav de fleste er ISG-er.
Identifikasjon av differensielt uttrykte tverrbundne proteiner som respons på IFNa (data hentet fra MaxQuant).(A) Venn-diagram som representerer antall vanlige og eksklusive peptider identifisert i IFNα14-behandlede og ubehandlede Flo-1-prøver.Peptidlengdefordeling av ubehandlede (B) og IFNa-behandlede (C) tverrbundne prøver.(D) Varmekart som representerer log2 (LFQ-intensitet) mellom ubehandlede og IFNα14-behandlede Flo-1-celler.Det venstre panelet viser proteinene som er mest aktivt aktivert i nærvær av IFNa.(E) Histogram som representerer de 20 viktigste anrikningsveiene etter IFNa-behandling.Reactome pathway-databasen analyserte mer enn fire ganger endringer i oppregulerte IFNa-responsive proteiner.
Interferon-mediert ISG-stimulering er godt dokumentert, men på molekylært nivå er det dårlig forstått hvordan disse proteinene kulminerer i et bredt spekter av biologiske funksjoner.Vi undersøkte proteininteraksjoner med høy grad av sikkerhet mellom kjente ISG-er.Interessant nok identifiserte vi et nettverk inkludert MX1-, USP18-, ROBO1-, OAS3- og STAT1-proteiner som danner et stort kompleks som svar på IFNa-behandling (figur 4, tabell S2) 32,33,34.Det viktigste er at disse interaksjonene ble funnet i alle triplikater behandlet med IFNa og ble ikke funnet i ubehandlede prøver, noe som tyder på at de ble dannet spesifikt som respons på IFNa-behandling.Det er kjent at STAT1 transkripsjonelt regulerer uttrykket av disse ISG-ene, men dets interaksjon med ISG-er på proteinnivå er ikke studert.Krystallstrukturen til STAT1 viste at dets spiralformede domene (CCD) ikke er involvert i interaksjonen med DNA eller protomerer under dannelsen av dimerer35.Disse α-heliksene danner en spiralformet helixstruktur som gir et overveiende hydrofilt overflateareal for at interaksjoner kan oppstå 35 .I CLMS-dataene våre observerte vi at de fleste interaksjonene med STAT1 skjedde i SH2-domenet foran CCD, linkerdomenet eller den C-terminale halen (restene 700-708) (Figur 4A).En tidligere studie rapporterte at USP18 binder seg til CCD og DNA-bindende domene (DBD) til STAT2 og rekrutteres til underenheten til type I interferonreseptoren IFNAR2 for å mediere hemming av type I interferonsignalering 24 .Dataene våre viste også at det katalytiske domenet USP18 samhandler med STAT1 DBD (Figur 4A, D), noe som tyder på at både STAT1 og STAT2 kan spille en rolle i å tiltrekke USP18 til IFNAR2.
Protein-protein ISG-nettverk identifisert i tverrbundne celler behandlet med IFNa.(A) 2D-interaksjonsplott som viser protein-protein-interaksjoner (generert i SIM-XL-programmet), med linjer som representerer intermolekylære interaksjoner (crosslink cutoff satt til 3,5).Domener med forskjellige identiteter er merket med deres farge32: MX1-domene, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) og GED (569–660).OAS3-domener: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) og OAS1_C (903-108).Domene ROBO1, Ig_3 (67–151), I-sett (170–258), I-sett (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) og fn3 (777–864).STAT1-felt: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) og STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Sirkulær visning av tverrbundne proteiner (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 og STAT1) med interaksjoner og interaksjoner merket i henholdsvis blått og rødt.Tverrbindingsterskelen ble satt til 3,5.Punktplott indikerer STAT1-interaksjonssteder med MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) og OAS3 (F), samt K- eller S-interaksjonssteder mellom de to peptidene.I figuren er grenseverdien for krysskoblingsscore satt til 3,0.(G) Ulike interaksjonssteder mellom STAT1 og OAS3 DI domener overlagret på proteinstrukturene deres i PyMol (PyMOL molecular graphics system, versjon 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) og OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
To isoformer av USP18 er blitt beskrevet hos mennesker, et protein i full lengde som hovedsakelig er lokalisert i kjernen, og en isoform uten et N-terminalt domene, USP18-sf, som er jevnt fordelt i cytoplasma og kjerne 36 .I tillegg ble N-terminalen spådd å være ustrukturert og krever ikke isopeptidaseaktivitet eller ISG1537-binding.De fleste av interaksjonene identifisert i vår studie var lokalisert ved N-terminalen av proteinet, noe som antyder at disse interaksjonene involverer full-lengde USP18 (Figur 4A, D) og dermed sannsynligvis forekommer i kjernen.Dessuten indikerer våre data også at N-terminalen er spesialisert for protein-til-protein-interaksjoner.IFNAR2-bindingssetet er lokalisert mellom restene 312-368, og spesielt binder ingen av proteinene i komplekset seg til denne regionen (fig. 4A) 37,38.Disse dataene samlet indikerer at IFNAR2-bindingsdomenet utelukkende brukes av reseptorproteinet.I tillegg ble bare OAS3 og ROBO1 funnet å være assosiert med domener oppstrøms for N-terminalen og IFNAR2-bindingssetet (figur 4A).
ROBO1 tilhører immunoglobulin (Ig)-superfamilien av transmembrane signalmolekyler og består av fem Ig-domener og tre fibronektin- (Fn)-domener i den ekstracellulære regionen.Disse ekstracellulære domenene følges av en membranproksimal region og en enkelt transmembranhelix 39. En ustrukturert intracellulær region er lokalisert ved C-terminalen og inneholder konserverte sekvensmotiver som medierer effektorproteinbinding39.Regionen som strekker seg fra aminosyrer ~1100 til 1600 er for det meste uordnet.Vi fant at MX1 interagerer med ROBO1 gjennom Ig, Fn og intracellulære domener, mens de fleste interaksjoner med STAT1 forekommer mellom CCD, linkerdomenet og C-terminalen til ROBO1 (fig. 4A,E).På den annen side ble interaksjoner med DI-, DIII- og OAS3-linkerregioner fordelt over hele ROBO1-proteinet (fig. 4A).
Oligoadenylatsyntase (OAS)-proteinfamilien aksepterer og binder intracellulært dobbelttrådet RNA (dsRNA), gjennomgår konformasjonsendringer og syntetiserer 2′,5′-koblede oligoadenylater (2-5 As) 40 .Det ble funnet at blant de tre OAS-ene, viser OAS3 den høyeste affiniteten for dsRNA og syntetiserer den minste mengden 2-5 As, som kan aktivere RNase L og dermed begrense viral replikasjon 41 .OAS-familien består av polymerase beta (pol-β)-lignende nukleotidtransferasedomener.Tidligere forskning har vist at den katalytiske aktiviteten til det C-terminale domenet (DIII) er avhengig av det dsRNA-bindende domenet (DI), som kreves for aktivering av OAS342.Vi observerte at DI- og DII-domenene til OAS3 samhandler med CCD og et lite kryssområde mellom SH2 og STAT1 TAD (Figur 4A, F).Å overlegge forskjellige tverrbindingssteder på proteinstrukturen avslørte en interaksjon mellom β-arket og DBD STAT1-løkken og en åpen lomme eller hulrom dannet av rester 60–75 i DI-domenet til OAS3 (fig. 4G).Orienteringen av proteinene i komplekset indikerte også at ingen av interaksjonene med OAS3 interfererte med DNA-bindingsevnen til dets DI-domene (fig. S1A).I tillegg samhandler det N-terminale domenet til GTPase MX1 mye med DI- og DIII-domenene til OAS3 (fig. 4A).Vi observerte også en interaksjon mellom OAS1 og MX1 i alle tre IFNa-behandlede gjentakelser, der et enkelt OAS1-domene (også katalytisk aktivt) interagerte med alle tre MX1-domener (figur S2A,B).
MX-proteiner er en del av en stor familie av dyneinlignende GTPaser som inneholder et N-terminalt GTPase-domene som binder og hydrolyserer GTP, et mellomdomene som medierer selvmontering, og en C-terminal leucinglidelås som fungerer som en GTPase (LZ). ).domene effektor domene25,43.MX1 binder seg til underenheter av virale polymeraser for å blokkere transkripsjon av det virale genet43.En tidligere rapportert gjær-to-hybrid-skjerm viste at PIAS1-assosiert MX1 hemmer STAT1-mediert genaktivering ved å blokkere DNA-bindende aktivitet og har også SUMO E344,45 ligaseaktivitet.Her demonstrerer vi at MX1 binder seg til STAT1 (figur 4C, D), men hvordan denne interaksjonen påvirker STAT1-mediert genaktivering som respons på IFNa trenger ytterligere studier.I tillegg fant vi også at MX1 interagerte med IFIT3 og DDX60 i alle tre IFNa-behandlede gjentakelser (fig. S2C).
DDX60 er en IFN-indusert cytoplasmatisk helikase som tidligere har blitt rapportert å spille en rolle i RIG-I-uavhengig nedbrytning av viralt RNA46.Den samhandler med RIG-I og aktiverer dens signalering på en ligandspesifikk måte 46. DDX60 består av et DEXD/H-Box-helikasedomene og et C-terminalt helikasedomene som binder viralt RNA og DNA47.De fleste av dens interaksjoner med MX1 og IFIT3 forekommer innenfor lange N- og C-terminale områder uten kanoniske domener eller motiver (fig. S2E, F).Imidlertid er MX1 ​​også assosiert med DEXD/H-Box helicase-domenet (fig. S2E).Proteiner fra IFIT-familien har tandemkopier av et særegent helix-turn-helix-motiv kalt tetrapeptidrepetisjonen (TPR).IFIT3 ble funnet å være en positiv modulator av RIG-I-signalering og dermed en komponent av MAVS-komplekset.Samlet antyder dataene våre at IFIT3 og DDX60 samhandler primært i regionen mellom TPR 3–6 av IFIT3 og kan spille en rolle i RIG-I/MAVS-signalering (fig. S2F).
Gitt at screening av hele proteomet er beregningsintensivt, screenet vi deretter hele den humane UniProt-databasen for tilstedeværelse av en av de IFNa-behandlede gjentakelsene.I denne kopien fant vi flere svært pålitelige interaksjonsnettverk for HLA-A.Analyse av proteinveier identifisert av MS/MS-spektra viste at MHC-I-basert antigenbehandling og presentasjon er hovedveien indusert av interferon (fig. 3D).Derfor fokuserte vi på å studere proteininteraksjonene til MHC-I-molekyler med høy grad av sikkerhet i alle tverrbundne prøver.HLA består av α1, α2 og α3 domener og lette kjeder, og mikroglobulin β2 (β2m) er et konstant chaperonprotein49.Når HLA er satt sammen i det endoplasmatiske retikulum, er det ustabilt i fravær av peptidligander50.Det peptidbindende sporet dannes av de svært polymorfe og ustrukturerte α1- og α2-domenene i ikke-peptidform og det relativt mindre polymorfe α351-domenet.I nærvær av IFNa oppdaget vi to HLA-A-komplekser: en interagerer med HMGA1 og H2B (figur 5, tabell S3) og den andre interagerer med MDN1, LRCH4 og H2B (figur 6).
IFNa induserer et HLA-A-interaksjonsnettverk med H2B (H2BFS) og HMGA1.(A) 2D-plott (generert i SIM-XL-programvare) som viser forskjellige typer interaksjoner i H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset: interlink (blå), interlink (rød) og enkel lenke (svart)..Domener med forskjellige identiteter er fargekodet32: H2B (histone; 2–102) og MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppe C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364).Tverrbindingsterskelen ble satt til 3,5.Punktplott indikerer HLA-A-interaksjonsseter med H2B (B) og HMGA1 (C), samt K- eller S-interaksjonsseter mellom de to peptidene.I figuren er grenseverdien for krysskoblingsscore satt til 3,0.(D) Forhold mellom proteiner vist i strukturene til H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinene i PyMOL-programmet.Disse strukturene ble modellert ved å bruke Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) og malstrukturene for H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinene var henholdsvis 1kx552, 1kj349 og 2eze55.
IFNa induserer et HLA-A-interaksjonsnettverk med H2B (H2BFS), MDN1 og LRCH4.(A) Intramolekylære (røde) og intermolekylære (blå) tverrbindinger presentert på et 2D interaktivt kart (generert i SIM-XL-programvare) med MDN1 representert som en sirkel.Tverrbindingsterskelen ble satt til 3,5.Domener med forskjellige identiteter er fargekodet32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppe C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364) og LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) og CH (535–641)).(B) Forhold mellom proteiner vist i strukturene til H2B-, HLA-A-, LRCH4- og MDN1-proteinene i PyMOL-programmet.Disse strukturene ble modellert ved å bruke Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) med malstrukturer 1kx552, 1kj349, 6hlu62 og 6i2665 for H2B-, HLA-A-, LRCH4- og MDN1-proteinene, hhv.Punktplott som viser K- eller S-interaksjonssteder for HLA-A med H2B (C), LRCH4 (D) og MDN1 (E).For plott ble grenseverdien for krysskoblingsscore satt til 3,0.
I tillegg til å opprettholde integriteten til genomet, er histon H2B også involvert i reguleringen av transkripsjon.H2B-proteinet består av et sentralt histondomene (HFD) dannet av tre α-helikser atskilt med løkker og en C-terminal hale 41,52.Det meste av interaksjonen med H2B skjer i α1-helixen, som gir trimerisering med HFD-heterodimeren (fig. 5A,B).Selv om lysiner er involvert i DNA-binding, er noen lysiner også alternative acetylerings- eller metyleringssteder.For eksempel er restene K43, K46 og K57 fra H2B ikke involvert i direkte DNA-binding, men er mål for ulike post-transkripsjonelle modifikasjoner53.På samme måte kan restene K44, K47 og K57 i H2B spille en alternativ rolle i nærvær av IFNa, inkludert interaksjoner med andre proteiner (fig. 5A, B).I tillegg aktiverer den ekstrakromosomale histonen H2B immunresponsen i ulike celletyper, og fungerer som en cytosolisk sensor for å oppdage dobbelttrådete DNA (dsDNA)-fragmenter avledet fra smittestoffer eller skadede celler54.I nærvær av DNA-virus hemmet H2B-utarming IFN-β-produksjon og STAT154-fosforylering.H2B er også kjent for å bevege seg inn og ut av kjernen raskere enn andre kjernehistoner54.H2B-interaksjoner med MDN1 og LRCH4 ble også observert i utvalgte ubehandlede prøver.Vi fant at HLA-A interagerte med H2B i alle tre IFNa-behandlede prøvene og i en ubehandlet gjentatt prøve.Disse dataene gjenspeiler rollen til H2B i en alternativ fysiologisk funksjon uavhengig av transkripsjonsregulering.
HMGA1 (høy mobilitetsgruppe AT-krok 1), et lite nukleoprotein rikt på sykdomsfremmende aminosyrer, er identifisert i forbindelse med HLA-A.Den har en sur C-terminal hale og tre distinkte DBD-er kalt AT-kroker fordi de binder seg til det mindre sporet i den AT-rike regionen i dsDNA55,56.Denne bindingen får DNA til å bøye eller rette seg ut, slik at kanoniske transkripsjonsfaktorer får tilgang til konsensussekvensen.Den C-terminale halen antas å være involvert i protein-protein-interaksjoner og rekruttering av transkripsjonsfaktorer, siden C-terminale delesjonsmutanter ikke er i stand til å starte transkripsjon57.Dessuten inneholder dette domenet flere konserverte fosforyleringssteder som er kjente substrater for kinaser 58.Vi observerte HLA-A- og H2B-interaksjoner med HMGA1 utenfor det C-terminale domenet, noe som tyder på at det C-terminale domenet hovedsakelig brukes til transkripsjonsfaktorbinding (fig. 5A, C).HMGA-proteiner konkurrerer med histon H1 for binding til adapter-DNA, og øker dermed tilgjengeligheten57.Tilsvarende virker det sannsynlig at HMGA interagerer med histon H2B langs linker-DNA i konkurranse med histon H1.HMGB1 induserer ekspresjonen av HLA-A, -B og -C i dendrittiske celler, noe som fører til deres aktivering59, men en interaksjon mellom HMG og HLA er ikke tidligere rapportert.Vi fant at HMGA1 interagerer med α1- og α3-domenene til HLA-A, med de fleste av interaksjonene utenfor dens 3 DBD (figur 5A, C).I våre hender ble HLA-A funnet å være lokalisert i kjernen (data ikke vist), og gitt at H2B og HMGA1 også er tilstede i kjernen, forekommer denne interaksjonen sannsynligvis i kjernen.Spesifikke addukter målt mellom H2B, HLA-A og HMGA1 er vist i figur 5D.
De fleste interaksjoner av HLA-A med andre proteiner skjer innenfor dets α1- og α2-domener og det uordnede C-terminale domenet (fig. 6).I et av disse eksemplene fant vi at HLA-A interagerer med den uordnede N-terminale halen til LRCH4 (figur 6A,D).LRCH4 regulerer TLR4-aktivering og LPS-cytokininduksjon, og modulerer derved den medfødte immunresponsen60,61.Det er et membranprotein med ni leucinrike repetisjoner (LRR) og et calmodulin (CH) homologimotiv i dets ektodomene, etterfulgt av et transmembrandomene (TMD) 60, 62.CH-domener er rapportert å mediere protein-protein-interaksjoner 60 .En strekning på omtrent 300 aminosyrer mellom LRR- og CH-domenene er relativt tilgjengelig, men uordnet.Basert på funksjonen til forstyrrede regioner som mediatorer av protein-proteinnettverk og vesikulær transport 63, fant vi at de fleste proteininteraksjoner forekommer i uordnede regioner.Interaksjoner med MDN1 ble fordelt over hele lengden av proteinet, inkludert LRR1, LRR6, CH-domener og tilfeldige regioner, mens H2B hovedsakelig bundet til CH-domenet (fig. 6A, B).Spesielt inkluderte ingen av interaksjonene TMJ, noe som tyder på spesifisiteten til CLMS-tilnærmingen (figur 6A, B).
MDN1 har også blitt identifisert som en del av HLA-A-proteinnettverket (figur 6A).Den tilhører AAA-familien av proteiner (ATPaser assosiert med forskjellige aktiviteter).Dette er det samme N-terminale AAA-domenet som organiserer seg i en heksamerisk ring og fjerner monteringsfaktoren fra 60S 64 ribosomale underenheten.ser ut til å være lik dynein64,65,66.I tillegg følges den Asp/Glu-rike regionen av MIDAS-domenet (metallionavhengig sted).På grunn av den store størrelsen på MDN1 (omtrent 5600 aminosyrer) og dens begrensede homologi med godt studerte proteiner, er lite kjent om dens struktur og funksjon hos mennesker.Vi identifiserte HLA-A, H2B og LRCH4 som MDN1-bindingspartnere og avslørte deres orientering som proteinkomplekser i PyMol (fig. 6A,B).Disse tre proteinene samhandler med AAA-domenet, det dynein-lignende linkerdomenet og muligens MIDAS MDN1-domenet.I en tidligere rapport identifiserte affinitetsrensing av agnproteiner MDN1 som et protein assosiert med histon H2B67.I tillegg rapporterte en fersk studie også en interaksjon mellom MDN og HLA-B i HCT116-celler ved bruk av affinitetsrenset massespektrometri, noe som støtter funnene våre68.Identifikasjonen av dette komplekset i IFNa-behandlede prøver antyder en rolle for MDN1 i interferonsignalering.
Fordi HLA-gener er svært polymorfe, ekstraherte vi sekvenseringsleser kartlegging av HLA-A, -B og -C fra RNA-sekvenseringsdata fra Flo-1-celler (data ikke vist).Peptidsekvenser i samsvar med sekvenseringsavlesningen avslørte signifikante forskjeller mellom HLA-A, -B og -C i regioner der tverrbundne peptider var lokalisert i HLA-A (figur S3).I tillegg observerte vi ikke protein-til-protein-tverrbinding av HLA-B/C-molekyler med H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteiner.Dette antyder at proteininteraksjonen funnet mellom HLA-A, MDN1, LRCH1 og HMGA1 er HLA-A-spesifikk.I tillegg viste proteomisk analyse av ikke-tverrbundne prøver (tabell S4) at HLA-A har høyere sekvensdekning sammenlignet med HLA-B eller HLA-C.Peptidene identifisert for HLA-A hadde høy intensitet i både IFNa-behandlede og ubehandlede prøver.
For å sikre at interaksjonene identifisert her ikke skyldtes uspesifikk tverrbinding av to proteiner i umiddelbar romlig nærhet, bekreftet vi ytterligere to nye HLA-A-interagerende faktorer ved å utføre co-immunutfellingsanalyser.HLA-A-interaksjoner med endogen MDN1 og H2B ble påvist i både IFNa-behandlede og ubehandlede Flo-1-celler (figur 7, figur S4).Vi bekreftet at HLA-A ble fanget opp av H2B i immunutfellingene og at denne assosiasjonen skyldtes IFNa-behandling siden HLA-A var fraværende i immunutfellingsprøvene fra ubehandlede celler (figur 7A).Imidlertid antyder dataene våre at IFNa differensielt regulerer HLA-A-binding til H2B og MDN1.IFNa induserer assosiasjon mellom H2B og HLA-A, men reduserer assosiasjonen med MDN1.Vi fant at MDN1 var assosiert med HLA-A i kontroller, og tilsetningen av IFNa reduserte denne interaksjonen uavhengig av MDN1-induksjon av IFNa (figur 7B, C).I tillegg fanget HLA-A-immunutfelling H2B i A549-celler (fig. S4), noe som tyder på at denne interaksjonen er uavhengig av celletype.Til sammen støtter disse resultatene interferon-mediert interaksjoner av HLA-A med H2B og MDN1.
HLA-A co-renser H2B og MDN1.Representative endogene H2B (A) og MDN1 (B) immunoblotter ble immunutfelt fra IFNa-behandlede Flo-1 celler og undersøkt for de angitte antistoffene.Mus og kanin IgG ble brukt som en negativ kontroll.(C) Relative mengder (input) av forskjellige antigener er avbildet av immunoblots probet mot indikerte antistoffer, β-aktin ble brukt som en belastningskontroll.
De strukturelle egenskapene til et av de interferon-induserte svært pålitelige tverrbundne nettverkene, H2B-HLA-A-HMGA1, ble undersøkt.Vi brukte molekylær dynamikkmodellering som en alternativ tilnærming for å forstå konformasjonsdynamikken til proteinene involvert i dette komplekset (figur 8).Konklusjoner fra CLMS-dataene antyder muligheten for forskjellige konformasjoner av H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinene.Derfor ble følgende potensielle komplekser modellert i et løsningsmiddelmedium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1.En innledende protein-protein docking-skjerm ved bruk av MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) foreslo mulige konformasjoner som er forskjellige mellom disse proteinene (fig. 8A).Visualisering av dockingproteinkomplekset avslørte flere interaksjoner og mulige konformasjoner (figur 5A, 8).Således er en mulig konformasjon vist i figur 8A (med merkede tverrbindinger) og den ble videre evaluert ved å bruke MD-modelleringsrørledningen.I tillegg fremhever binding av H2B eller HMGA1 til HLA-A den høyere affiniteten til H2B for HLA-A (fig. 8A).
Konformasjonsdynamikk av mulige nettverk mellom H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksene.(A) Venstre panel er et 2D-kart (generert i SIM-XL-programvare) av intramolekylære (røde) og intermolekylære (blå) tverrbindinger (tverrbindingsavskjæring satt til 3,5).I tillegg er identifiserte tverrbindingsrester merket på strukturene til H2B-, HLA-A- og HMGA1-proteinene.De tilknyttede konformasjonene til disse proteinene ble ekstrahert ved å bruke docking-rørledningen implementert i MOE-pakken.Nedre venstre panel viser de forskjellige mulige konformasjonene av H2B-HLA-A- og HMGA1-HLA-A-kompleksene med forskjellige protein-proteinbindingsaffiniteter (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardavvik (RMSD) av atomposisjoner (unntatt hydrogenatomer) for hver proteinstruktur.(C) Intermolekylære protein-protein-hydrogenbinding-interaksjoner fra forskjellige simulerte komplekser med tanke på spesifikke interaksjoner med varighet ≥ 10 ns.H-bindingen donor-akseptor cutoff-avstand ble satt til 3,5 Å, og donor-H-akseptor cutoff-vinkelen ble satt til ≥ 160°–180°.(D) Merkede rester som danner HLA-A-protein-protein-interaksjoner med deres respektive partnere, som strekker seg over ≥ 20 ns, ekstrahert fra dummy-HLA-A-H2B- og HLA-A-HMGA1-komplekser.Proteinstrukturer representerer en gjennomsnittlig struktur på 100 ns MDS.(E) Interaksjoner mellom HLA-A-H2B- og HLA-A-HMGA1-komplekser sammenlignet med interaksjoner sporet av H2B-HLA-simulering over 100 ns basert på K- eller S-interaksjonsstedet mellom de to peptidene.Komplekser /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Terskelverdien for evaluering av tverrbindinger ble satt til 3,0, og spesifikke interaksjoner fra MDS som tok ≥ 10 ns ble tatt i betraktning.Proteinstrukturer ble visualisert ved bruk av BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) og Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
Stabiliteten til HLA-A-molekyler over tid (standardavvik; RMSD eller standardavvik; RMSF) indikerte at tilstedeværelsen av H2B- eller HMGA1-proteiner i kompleksene stabiliserte HLA-A (figur 8B, figur S5).HMGA1-proteinet binder seg tett til B2M-stedet til HLA-A, og induserer stabiliteten til HLA-A-aminosyrene i HLA-A-HMGA1- eller H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset (figur 8B, figur S5).spesielt ble HLA-rester ~60-90 og ~180-210 funnet å være mindre fleksible i nærvær av H2B (FIG. 8B).H2B og HMGA1 viste bedre binding til HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1-komplekset sammenlignet med HLA-A-binding til H2B eller HMGA1 alene (Figur 8C, D; Tabell S5).Rester involvert i hydrogenbinding (MD-modellert høy belegg ≥ 10 ns) faller sammen med CLMS-interaksjonssteder (K- eller S-rester) i komplekset, noe som tyder på at interaksjonene identifisert av CLMS er svært pålitelige.Pålitelighet (fig. 8E).I CLMS- og MD-modellering ble HLA-A-rester mellom ca. 190-210 og ca. 200-220 aminosyrer funnet å binde henholdsvis H2B og HMGA1 (FIG. 8E).
Protein-protein-interaksjoner danner dynamiske strukturelle nettverk som medierer intracellulær kommunikasjon som respons på visse stimuli.Fordi mange proteomikk-tilnærminger oppdager endringer i det generelle steady state-nivået til et protein, krever protein-protein-interaksjonsdynamikk ytterligere verktøy for å fange bindingsgrensesnitt, og CLMS er et slikt verktøy.Interferon-signalsystemet er et cytokinnettverk som lar celler reagere på en rekke miljøpatogene og iboende patologiske signaler, som kulminerer med induksjon av undergrupper av interferon-induserbare proteiner.Vi brukte CLMS for å bestemme om nye protein-protein-interaksjoner kunne identifiseres blant et panel av interferon-induserte proteiner.Global proteinkryssbindingsanalyse i en interferon-responsiv Flo-1-cellemodell ble brukt for å fange proteinkomplekser.Ekstraksjon av tryptiske peptider fra ikke-tverrbundne og tverrbundne celler tillater peptidtelling, anrikning av veier og peptidlengdefordeling med definert LFQ-intensitet.Kanoniske interferon-induserbare proteiner ble identifisert som en positiv intern kontroll, mens nye intermolekylære og intramolekylære tverrbundne addukter av kanoniske interferon-induserbare proteiner som MX1, UP18, OAS3 og STAT1 ble observert.Ulike strukturelle trekk og interaksjoner i funksjonsområder er undersøkt.
En interaksjon mellom HLA-A, MDN1 og H2B ble påvist ved immunoblotting i Flo-1- og A549-celler behandlet og ubehandlet med IFNa.Resultatene våre fremhever at HLA-A komplekserer med H2B på en IFNa-avhengig måte.Vårt arbeid representerer en interessant vei for videre utforskning av samlokaliseringen av disse to kompleksene.Det ville også være interessant å utvide CLMS-tilnærmingen til et panel av cellelinjer for å identifisere celletype-uavhengige interferon-mediert proteininteraksjoner.Til slutt brukte vi MD-modellering som en alternativ tilnærming for å forstå konformasjonsdynamikken til proteiner involvert i H2BFS-HLA-A-HMGA1-komplekset, som sporet intramolekylære og intermolekylære krysssamtaler.Konklusjoner fra CLMS-dataene antyder muligheten for forskjellige konformasjoner av H2BFS-, HLA-A- og HMGA1-proteinene.De mulige forskjellige konformasjonene mellom disse dockingproteinkompleksene avslørte flere interaksjoner som ligner på de som ble observert i CLMS-datasettet.En av hovedstyrkene til metoden vår er at den tillater enkel identifikasjon av interagerende svært polymorfe gener som HLA, så det vil være interessant å studere interaksjoner av HLA haplotype-spesifikke proteiner som ellers er vanskelige å studere.Samlet viser dataene våre at CLMS kan brukes til å utvide vår forståelse av interferon-induserte signalnettverk og gi grunnlag for å studere mer komplekse intercellulære systemer i tumormikromiljøet.
Flo-1-celler ble hentet fra ATCC og holdt i DMEM (Gibco) supplert med 1 % penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10 % føtalt bovint serum (Gibco) og lagret ved 37°C og 5 % CO2.Inkubasjon.Celler ble dyrket til 70-80% konfluens før de ble behandlet med IFNa14 (produsert av Edinburgh Protein Production Facility).Alle andre kjemikalier og reagenser ble kjøpt fra Sigma Aldrich med mindre annet er angitt.
Flo-1-celler ble dyrket i 6-brønners plater og neste dag ble cellene behandlet med 10 ng/ml IFNa14 i 24 timer til omtrent 80 % konfluens.Celler ble vasket tre ganger med PBS og ligert med nylaget DSS (Thermo Fisher Scientific) (oppløst i DMSO) i PBS i 5 minutter ved 37°C til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM.DSS-tverrbindingsreaksjonen ble erstattet med PBS og gjenværende DSS ble stoppet ved å tilsette 20 mM Tris (pH 8,0) i PBS i 15 minutter ved 37°C.Celler ble samlet ved skraping og samlet i rør med lav binding (Axygen).
Cellepelleten ble lysert med 300 ul urealysebuffer (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) i 30 minutter ved romtemperatur med sporadisk risting.Alle sentrifugeringstrinn ble utført ved 14 000 xg ved 8°C.Sentrifuger lysatet i 10 minutter og overfør supernatanten til et nytt rør.De gjenværende klare partiklene ble oppløst i 150 μl av den andre lyseringsbufferen (2 M urea, 2 % (w/v) SDS (natriumdodecylsulfat)) i 30 minutter eller mer inntil en homogen vandig løsning ble oppnådd.Lysatet ble sentrifugert i 20 minutter og supernatanten ble blandet med lysatet oppnådd i forrige trinn.Proteinkonsentrasjoner ble vurdert ved bruk av Micro BCA-analysen (Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner for mikroplateprosedyrer.Prøvene ble raskt frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C.
Omtrent 100 μg løselig tverrbundet protein ble behandlet ved bruk av en modifisert filtreringsprøveprepareringsprotokoll (FASP) som beskrevet av Wisniewski et al.69 Kort fortalt kryssbindes proteinet med 200 µl ureabuffer (8 M urea i 0,1 M Tris, pH 8,5), virvles og halveres.Alle sentrifugeringstrinn ble utført ved 14 000 xg ved 25°C.Den første halvdelen av det tverrbundne proteinlysatet ble overført til en 10 kDa Microcon sentrifugalfilteranordning utstyrt med en Ultracel-10 membran (Merck), etterfulgt av sentrifugering på filteret i 25 minutter.Legg deretter den andre halvdelen av proteinet til filteret og gjenta de samme trinnene.Proteingjenvinning ble utført ved å tilsette 100 μl 17 mM tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP) i ureabuffer.Utvinning ble omrørt på en termomixer ved 600 rpm i 30 minutter ved 37°C.I tillegg ble kolonnen sentrifugert og det reduserte tverrbundne proteinet ble alkylert ved bruk av 100 μl 50 mM jodacetamid i ureabuffer.Alkyleringsreaksjonen ble utført ved romtemperatur i 20 minutter i mørke.Roter kolonnen, vask kolonneveggene 3 ganger med 100 µl ureabuffer, og sentrifuger deretter.Den samme operasjonen ble utført 3 ganger ved bruk av 100 μl 100 mM ammoniumbikarbonat.Før trypsinisering erstattes oppsamlingsrøret med et nytt.Tilsett fordøyelsesbuffer som inneholder 50 mM ammoniumbikarbonat og 1 µl trypsin fortynnet i trypsinbuffer (Promega).Forholdet mellom trypsin og protein ble opprettholdt på ca. 1:33, og fordøyelsesreaksjoner ble inkubert over natten ved 37°C i et fuktig kammer.Det tverrbundne peptidet ble eluert fra filteret ved sentrifugering i 25 minutter.Peptidgjenvinningen ble forbedret ved å tilsette 50 μl 0,5 M NaCl til filteret, etterfulgt av sentrifugering i 25 minutter.
C18 Micro Spin-kolonner (Harvard Apparatus) ble brukt til å avsalte kryssbundne tryptiske peptider etter protokollen beskrevet av Bouchal et al.70 med mindre modifikasjoner.Kort fortalt ble C18-spinnkolonner aktivert med tre vaskinger med 0,1 % maursyre (FA) i acetonitril (AcN) (Merck) og to vaskinger med 0,1 % FA.Kolonnen ble hydratisert med 0,1% FA i 15 minutter.Legg prøver i spinnkolonner og vask 3 ganger med 0,1 % FA.De avsaltede peptidene ble sekvensielt eluert med en trinnvis gradient ved bruk av 50 %, 80 % og 100 % AcN i 0,1 % FA.Prøvene ble tørket i en SpeedVac Plus konsentrator (Eppendorf) inntil restvæsken forsvant fullstendig.De eluerte peptidene ble oppløst i 100 μl 0,08 % trifluoreddiksyre i 2,5 % AcN og konsentrasjonene ble målt på en NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Omtrent 1 μg tverrbundet peptid per prøve ble injisert i LC-MS/MS-systemet.
Tverrbundne peptider ble separert på et UltiMate 3000 RSLCnano LC-system (Thermo Scientific) koblet til et Orbitrap Exploris 480 massespektrometer (Thermo Scientific).Tverrbundne peptider ble samlet på en 300 µm ID, 5 mm lang µ-pre-kolonne C18 fangstkolonne pakket med C18 PepMap100 sorbent og 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Last pumpestrømsettet til 5 µl/min. 0,08 % trifluoreddiksyre oppløst i 2,5 % AcN.Tverrbundne peptider ble separert på en analytisk smeltet silikakolonne med en indre diameter på 75 μm og en lengde på 150 mm, fylt med en 2 μm PepMap-sorbent (Thermo Scientific).Mobile fase A og B besto av henholdsvis 0,1 % FA i vann og 0,1 % FA i acetonitril.Gradienten starter ved 2,5 % B og øker lineært til 40 % B i løpet av 90 minutter, deretter til 90 % B i løpet av de neste 2 minuttene.Den mobile fasesammensetningen ble holdt ved 90 % B i 10 minutter og ble deretter redusert lineært til 2,5 % B i løpet av 2 minutter.Kolonnen ble ekvilibrert ved 2,5 % B i 8 minutter før neste syklus.Tverrbundne peptider eluert fra den analytiske kolonnen ble ionisert i en nanoelektrosprayioniseringskilde (NSI) og injisert i et Exploris 480 massespektrometer (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 massespektrometer opererte i positiv datakorrelasjonsmodus.En full skanning ble utført i seksjonsmodus med en oppløsning på 120 000 med rekkeviddeinnstillinger fra m/z 350 Th til m/z 2000 Th.Det normaliserte AGC-målet ble satt til 300 % med en maksimal inngangstid på 50 ms.Monoisotopisk toppdeteksjon er etablert for peptider.Begrensningsrelaksasjonsparameteren settes til sann hvis det blir funnet for få forløpere.Minimum ionestyrke til forløperen ble satt til 5.0e3 og forløperladningstilstander opp til +8 ble inkludert i eksperimentene.
Syklustiden mellom store skanninger i datakorrelasjonsmodus ble satt til 2,5 sekunder.Dynamisk masseekskludering ble satt til 20 s etter den første fragmenteringen av forløperionet.Forløperisolasjonsvinduet ble satt til 2 Th.Typen normalisert kollisjonsenergi med en fast kollisjonsenergimodus ble valgt i en dataavhengig MS/MS-skanning.Kollisjonsenergi satt til 30 %.Orbitrap-oppløsningen ble satt til 15 000 og AGC-målet til 100 %.Den egendefinerte maksimale injeksjonstiden er satt til 60 millisekunder.
Før vi sporet protein-protein-nettverket i kryssbundne prøver, behandlet vi råfilene ved å bruke MaxQuant-pakken (versjon 1.6.12.0)26,27 for å identifisere sporbare peptider/proteiner i prøvene.I tillegg ble lignende proteomiske analyser utført på ikke-tverrbundne Flo-1-prøver behandlet og ubehandlet med IFNa.MS/MS-data ble søkt i UniProt human database (www.uniprot.org) (lastet opp 12. august 2020, inneholder 75 093 oppføringer) ved hjelp av den innebygde søkemotoren Andromeda27.Søket ble utført uten å indikere spesifisiteten til enzymet og ulike modifikasjoner av deamidering (N, Q) og oksidasjon (M).Forløpermassetoleranser ble satt til 20 ppm og produktioner til 0,02 Da.Det innledende og maksimale masseavviket ble satt til 10 ppm.Den maksimale massen av peptidet ble satt til 4600 Da og sekvenslikheten ble satt til mellom 7 og 25 aminosyrer (aa).Ytterligere statistisk analyse ble utført ved bruk av Perseus-programmet (versjon 1.6.10.45).Proteininnholdet ble beregnet ved å normalisere den spektrale intensiteten til proteinet (LFQ-intensitet; umerket kvantifisering)27 og intensitetsverdiene ble konvertert til Log2.En hierarkisk klynging av proteiner identifisert ved deres peptidintensitet ble bygget ved å bruke pheatmap (v1.0.12)-pakken i R (v 4.1.2).Baneanrikningsanalyse ble utført ved å bruke Reactome pathway-databasen for IFNa-behandlede proteiner som var mer enn fire ganger aktivert sammenlignet med ubehandlede prøver.
Identifikasjon av lysin (K) eller serin (S) spesifikke kjemiske tverrbindinger av proteinkomplekser overvåket med LC-MS/MS ble utført ved bruk av en spektroskopisk identifikasjonsmaskin (SIM-XL) for tverrbundne peptider (SIM-XL)29.Først ble mulige interaksjoner mellom interferon-assosierte (IFN) DNA-skaderesistens-signaturgener (IRDS) gener undersøkt ved å bruke IRDS-proteindatasettet beskrevet i Padariya et al.28.Screening av alle tilstander og gjentakelser av hele den menneskelige UniProt er beregningsintensiv, så hele den menneskelige UniProt-databasen (www.uniprot.org) (lastet ned 12. august 2020, inneholder 75 093 oppføringer) mot IFNα-behandlede gjentakelser.Et av filtrene for interaksjoner med høy tillit.Disse oppnådde interaksjonene med høy signifikans ble utvidet og testet under alle repetisjoner og forhold.
I SIM-XL ble DSS brukt for tverrbinderen (XL) og XL vektforskyvning og endringsvekt ble satt til henholdsvis 138,06 og 156,07.Følgende tverrbindingsreaksjonsseter er vurdert: KK, KS og KN-TERM, uten reporterioner.Både forløper og fragment ppm ble satt til 20 og Xrea-terskelen ble satt til 0,15.Trypsin ble ansett for å være helt spesifikt, og en høyenergi C-felle (HCD) fragmenteringsmetode ble implementert.XCorr dynamisk DB-reduksjonsterskel og minimum antall peptider for dynamisk DB-reduksjon ble satt til henholdsvis 2,5 og 2.Andre parametere er: monoisotopsannsynlighet og toppsammenfallsavskjæring, minimum 4 AA-rester per tråd og maksimal trådladning, og 3 maksima for tapte spaltninger.De resulterende sammensydde 2D-kartene ble analysert i (SIM-XL) og den grafiske representasjonen xQuest28 ble brukt til å bygge 2D-kartene.Proteinkryssbindinger på proteinstrukturer er gitt i PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versjon 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteinmodellstrukturer ble opprettet ved å bruke Phyre2-serveren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ved å bruke prinsippene for homologimodellering og implementering av "Hidden Markov Method".Phyre2 genererer modellstrukturer basert på sekvensjustering med kjente proteinstrukturer.For H2BFS-, HLA-A-, HMGA1-, LRCH4- og MDN1-proteiner ble malstrukturene 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 og 6i2665 brukt.I tillegg ble strukturen til AlphaFold71 MX1, UBP18 og ROBO1 også vurdert.Proteinstrukturen ble visualisert ved bruk av BIOVIA Discovery Studio Visualizer-pakken (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) og Molecular Operating Environment-pakken (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).