347 12,7*1,24 mm kveilrør i rustfritt stål, molekylær mekanisme for synkron elektrostatisk kondensasjon og koaggregering av α-synuklein og tau

Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Skyveknapper som viser tre artikler per lysbilde.Bruk tilbake- og neste-knappene for å gå gjennom lysbildene, eller lysbildekontrollknappene på slutten for å gå gjennom hvert lysbilde.

347 rustfritt stålrør spesifikasjon

347 12,7*1,24mm Kveilet rør i rustfritt stål

Utvendig diameter: 6,00 mm OD opp til 914,4 mm OD, størrelser opptil 24” NB tilgjengelig på lager, OD-størrelse Stålrør tilgjengelig på lager

SS 347 Rørtykkelsesområde: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Eller ikke-vanlig størrelse for å skreddersys etter behov

Type: SS 347 sømløse rør |SS 347 ERW Rør |SS 347 sveisede rør |SS 347 Fabrikkrør |SS 347 CDW-rør, LSAW-rør / søm-sveiset / omtegnet

Form: SS 347 runde rør/rør, SS 347 firkantede rør/rør, SS 347 rektangulære rør/rør, SS 347 kveilrør, SS 347 "U" form, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 hydrauliske rør

Lengde: Enkelt tilfeldig, dobbel tilfeldig og nødvendig lengde ende: vanlig ende, skrå ende, tråkket

Endebeskyttelse: Plastkapsler |Utvendig finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Speilfinish for rustfrie stålrør, finish i henhold til kundens krav

Leveringstilstand: glødet og syltet, polert, lyst glødet, kaldtrukket

Inspeksjon, testrapporter: Mill testsertifikater, EN 10204 3.1, kjemiske rapporter, mekaniske rapporter, PMI testrapporter, visuelle inspeksjonsrapporter, tredjeparts inspeksjonsrapporter, NABL-godkjente laboratorierapporter, destruktiv testrapport, ikke-destruktive testrapporter

Pakking: Pakket i trebokser, plastposer, stålstrimler buntet, eller i henhold til kundens forespørsler

Spesialtilbud: Andre størrelser og spesifikasjoner enn ovenfor kan produseres på forespørsel

SS 347 rørstørrelsesområde: 1/2 tommer NB, OD til 24 tommer

ASTM A312 347: Sømløst og rettsømsveiset austenittisk rør beregnet for høytemperatur og generell korrosiv drift.Fyllmetall ikke tillatt under sveising.

ASTM A358 347: Elektrisk smeltesveiset austenittisk rør for korrosiv og/eller høytemperaturservice.Vanligvis produseres bare rør opp til 8 tommer i henhold til denne spesifikasjonen.Tilsetting av tilsatsmetall er tillatt under sveising.

ASTM A790 347: Sømløst og rettsømsveiset ferritisk/austenittisk (dupleks) rør beregnet for generell korrosiv bruk, med spesiell vekt på motstand mot spenningskorrosjonssprekker.

ASTM A409 347: Rettsøm eller spiralsøm elektrisk smeltesveiset austenittisk lettveggrør med stor diameter i størrelsene 14" til 30" med vegger Sch5S og Sch 10S for korrosive og/eller høye

ASTM A376 347: Sømløst austenittisk rør for høytemperaturapplikasjoner.

ASTM A813 347: Enkeltsømmet, enkelt- eller dobbeltsveiset austenittisk rør for høytemperatur og generelle korrosive applikasjoner.

ASTM A814 347: Kaldbearbeidet sveiset austenittisk rør for høy temperatur og generell korrosiv drift.

347H rustfrie stålrør Kjemisk sammensetning

Rustfritt stål 347H rør mekaniske egenskaper

Rustfritt stål 347H rør Fysiske egenskaper

Tilsvarende karakterer for 347H rustfritt stålrør

Amyloid alfa-synuklein (αS) aggregering er et kjennetegn på Parkinsons sykdom og andre synukleinopatier.Nylig har tau-proteinet som vanligvis er assosiert med Alzheimers sykdom blitt assosiert med αS-patologi og funnet å samlokalisere seg i αS-rike inneslutninger, selv om den molekylære mekanismen for koaggregering av de to proteinene fortsatt er uklar.Vi rapporterer her at αS-fasen separeres til flytende kondensater via elektrostatisk komplekskondensasjon med positivt ladede polypeptider som tau.Avhengig av affiniteten til αS for polykationer og graden av valensutarming av koagulasjonsnettverket, gjennomgår koagler rask gelering eller koalescens etterfulgt av langsom amyloidaggregering.Ved å kombinere en rekke avanserte biofysiske teknikker, var vi i stand til å karakterisere væske-væske αS/Tau-faseseparasjonen og identifisere nøkkelfaktorene som fører til dannelsen av heterogene aggregater som inneholder begge proteinene i et flytende proteinkondensat.
I tillegg til membranrom, kan romlig separasjon i celler også oppnås ved dannelse av proteinrike, væskelignende tette legemer kalt biomolekylære kondensater eller dråper, gjennom en prosess kjent som væske-væskefaseseparasjon (LLPS).Disse dråpene dannes av multivalente tidsinteraksjoner, vanligvis mellom proteiner eller proteiner og RNA, og tjener en rekke funksjoner i nesten alle levende systemer.Et stort antall LLP-kompatible proteiner viser sekvenser med lav kompleksitet som er svært uorden i naturen og i dannelsen av biomolekylære kondensater3,4,5.Tallrike eksperimentelle studier har avslørt den fleksible, ofte uordnede og multivalente naturen til proteinene som utgjør disse væskelignende kondensatene, selv om lite er kjent om de spesifikke molekylære determinantene som kontrollerer veksten og modningen av disse kondensatene til en mer fast-lignende stat..
De nye dataene støtter hypotesen om at avvikende proteindrevet LLPS og transformasjon av dråper til faste strukturer kan være relevante cellulære veier som fører til dannelse av uløselige giftige aggregater som ofte er kjennetegn på degenerative sykdommer.Mange LLPS-assosierte iboende forstyrrede proteiner (IDP), ofte svært ladede og fleksible, har lenge vært assosiert med nevrodegenerasjon gjennom prosessen med amyloidaggregering.Spesielt har biomolekylære IDP-kondensater som FUS7 eller TDP-438 eller proteiner med store lavkompleksitetsdomener som hnRNPA19 vist seg å eldes til gellignende eller til og med faste former gjennom en prosess som kalles fluidisering.sammensatt.til fastfaseovergang (LSPT) som en funksjon av tid eller som respons på visse post-translasjonelle modifikasjoner eller patologisk signifikante mutasjoner1,7.
En annen IDP assosiert med LLPS in vivo er Tau, et mikrotubule-assosiert forstyrret protein hvis amyloidaggregering har vært implisert i Alzheimers sykdom10, men har også nylig blitt implisert i Parkinsons sykdom (PD) og andre synaptiske nukleære proteinopatier 11, 12, 13 er relatert.Tau har vist seg å dissosiere spontant fra løsning/cytoplasma på grunn av gunstige elektrostatiske interaksjoner14, noe som resulterer i dannelsen av tau-anrikede dråper kjent som elektrostatiske koacervater.Det har også blitt observert at denne typen uspesifikke interaksjoner er drivkraften bak mange biomolekylære kondensater i naturen15.Når det gjelder et tau-protein, kan elektrostatisk aggregering dannes ved enkel aggregering, der motsatt ladede områder av proteinet utløser spaltningsprosessen, eller ved kompleks aggregering gjennom interaksjon med negativt ladede polymerer som RNA.
Nylig har α-synuklein (αS), en amyloid IDP involvert i PD og andre nevrodegenerative sykdommer, samlet kjent som synukleinopati17,18, blitt demonstrert i cellulære og dyremodeller19,20 konsentrert i proteinkondensat med væskelignende oppførsel.In vitro-studier har vist at αS gjennomgår LLPS ved enkel aggregering gjennom overveiende hydrofobe interaksjoner, selv om denne prosessen krever eksepsjonelt høye proteinkonsentrasjoner og atypisk lange inkubasjonstider19,21.Hvorvidt de αS-holdige kondensatene observert in vivo er dannet av denne eller andre LLPS-prosesser er fortsatt et viktig uløst problem.Tilsvarende, selv om aS-amyloidaggregering har blitt observert i nevroner i PD og andre synukleinopatier, forblir den nøyaktige mekanismen som αS gjennomgår intracellulær amyloidaggregering uklar, ettersom overekspresjon av dette proteinet ikke ser ut til å utløse denne prosessen i seg selv.Ytterligere cellulær skade er ofte nødvendig, noe som antyder at visse cellulære steder eller mikromiljøer er nødvendige for gjennukleering av intracellulære αS-amyloidsammenstillinger.Et cellulært miljø som er spesielt utsatt for aggregering kan være det indre av proteinkondensat 23 .
Interessant nok har αS og tau blitt funnet å samlokalisere i karakteristiske sykdomsinkluderinger hos mennesker med Parkinsons sykdom og andre synukleinopatier 24,25 og eksperimenter har rapportert en synergistisk patologisk sammenheng mellom de to proteinene 26,27, noe som tyder på en potensiell sammenheng mellom aggregering αS og tau ved nevrodegenerative sykdommer.sykdom.αS og tau har vist seg å samhandle og fremme hverandres aggregering in vitro og in vivo 28,29 og heterogene aggregater sammensatt av disse to proteinene er observert i hjernen til pasienter med synukleinopatier 30 .Imidlertid er lite kjent om det molekylære grunnlaget for interaksjonen mellom αS og tau og mekanismen for dens koaggregering.αS har blitt rapportert å samhandle med tau gjennom en elektrostatisk tiltrekning mellom den svært negativt ladede C-terminale regionen til αS og den sentrale prolinrike regionen av tau, som også er anriket på positivt ladede rester.
I denne studien viser vi at αS faktisk kan dissosiere til dråper via elektrostatisk komplekskondensasjon i nærvær av tau-protein, i motsetning til dets interaksjon med andre positivt ladede polypeptider som poly-L-lysin (pLK), og i denne prosessen.αS fungerer som et stillasmolekyl for dråpenettverket.Vi har identifisert merkbare forskjeller i prosessen med modning av elektrostatiske αS-koacervater, som er assosiert med forskjeller i valensen og styrken til interaksjonen mellom proteiner involvert i koacervatnettverket.Interessant nok observerte vi koaggregering av αS og tau amyloidproteiner i langlivede flytende koacervater og identifiserte noen nøkkelfaktorer som fører til koaggregering av disse to proteinene i slike koacervater.Her beskriver vi i detalj denne prosessen, som er en mulig molekylær mekanisme som ligger til grunn for kolokaliseringen av to proteiner i sykdomsspesifikke inneslutninger.
αS har en svært anionisk C-terminal hale ved nøytral pH (fig. 1a), og vi antok at den kunne gjennomgå LLPS gjennom kondensering av elektrostatiske komplekser med polykationiske forstyrrede polypeptidmolekyler.Vi brukte en 100-rester poly-L-lysin (pLK) som startmodellmolekylet på grunn av dets positivt ladede og uordnede polymere natur ved nøytral pH 32. Først bekreftet vi at pLK interagerer med Ct-domenet til αS via Solution NMR-spektroskopi (Figur 1b) ved bruk av 13C/15N-merket αS i nærvær av økende αS:pLK molforhold.Interaksjonen av pLK med Ct-domenet til αS manifesterer seg i forstyrrelser av det kjemiske skiftet og en reduksjon i toppintensiteten i denne regionen av proteinet.Interessant nok, når vi blandet αS med pLK ved en αS-konsentrasjon på ca.5–25 µM i nærvær av polyetylenglykol (5–15 % PEG-8) (typisk LLPS-buffer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) gikk vi umiddelbart gjennom et bredt felt av proteindannelse .dråper ble observert ved bruk av fluorescens (WF) og lysfelt (BF) mikroskopi (fig. 1c).1-5 µm dråper som inneholder konsentrert αS (tilsatt 1 µM AlexaFluor488-merket αS, AF488-αS), deres elektrostatiske egenskaper kan utledes fra deres motstand mot 10 % 1,6-heksandiol (1,6-HD) og dens følsomhet overfor en økning i NaCl-konsentrasjon (fig. 1c).Den væskelignende naturen til koacervatene til det elektrostatiske αS/pLK-komplekset er demonstrert ved deres evne til å smelte sammen i løpet av millisekunder (fig. 1d).Ved å bruke turbidimetri kvantifiserte vi dannelsen av dråper under disse forholdene, bekreftet den elektrostatiske naturen til hovedinteraksjonen forbundet med stabiliteten (fig. 1e), og evaluerte effekten av ulike polymerforhold på LLPS-prosessen (fig. 1f).Selv om dråpedannelse observeres over et bredt spekter av polymerforhold, er prosessen svært gunstig når pLK er i overkant av αS.LLP-er har også blitt observert ved bruk av det kjemisk forskjellige fortrengningsmidlet dextran-70 (70 kDa) eller ved bruk av en rekke prøveformater, inkludert glassglassdråper, mikroplatebrønner av forskjellige materialer, Eppendorf- eller kvarts-kapillærer.
en skjematisk representasjon av forskjellige proteinregioner i WT-αS- og ΔCt-αS-variantene brukt i denne studien.Det amfipatiske N-terminale domenet, det hydrofobe amyloiddannende (NAC) området og det negativt ladede C-terminale domenet er vist i henholdsvis blått, oransje og rødt.Netto Charge Per Residual (NCPR) kart over WT-αS vises.b NMR-analyse av αS/pLK-interaksjonen i fravær av makromolekylære klumper.Når pLK-konsentrasjonen øker (aS:pLK-molforhold på 1:0,5, 1:1,5 og 1:10 vises i henholdsvis lysegrønt, grønt og mørkegrønt).c Koacervat αS/pLK (molart forhold 1:10) ved 25 µM (1 µM AF488-merket αS eller Atto647N-merket pLK for WF-avbildning) i LLPS-buffer (øverst) eller supplert med 500 mM NaCl (nederst til venstre) eller etter 10 % 1,6-heksandiol (1,6-HD; nederst til høyre).Målestokk = 20 µm.d Representative mikroskopiske bilder av BF-dråpefusjon av αS/pLK (molforhold 1:10) ved en konsentrasjon på 25 μM;piler indikerer sammenslåing av individuelle dråper (røde og gule piler) til en ny dråpe (oransje pil) innen 200 ms).Målestokk = 20 µm.e Lysspredning (ved 350 nm) αS/pLK-aggregering i LLPS-buffer før og etter tilsetning av 500 mM NaCl eller 10 % 1,6-HD ved 25 µM αS (N = 3 prøvereplikater, gjennomsnitt og standardavvik er også indikert).f BF-bilde (øverst) og lysspredningsanalyse (ved 350 nm, bunn) av αS/pLK-aggregering ved 25 μM αS med økende αS:pLK-molforhold (N = 3 prøvereplikater, gjennomsnitt og standardavvik er også indikert).Målestokk = 10 µm.Skaleringslinjen på ett bilde indikerer skalaen til alle bildene i ett panel.Rådata leveres i form av rådatafiler.
Basert på våre observasjoner av αS/pLK elektrostatisk komplekskondensasjon og tidligere observasjoner av αS som et klientmolekyl av tau/RNA-kondensatet gjennom direkte interaksjon med tau31, antok vi at αS og tau kunne samsegregere med løsningsmidlet i fravær av RNA kondensasjon.gjennom elektrostatiske komplekser, og αS er stillasproteinet i αS/Tau-koacervater (se tau-ladningsfordeling i figur 2e).Vi observerte at når 10 μM αS og 10 μM Tau441 (som inneholdt henholdsvis 1 μM AF488-αS og 1 μM Atto647N-Tau) ble blandet sammen i LLPS-buffer, dannet de lett proteinaggregater som inneholdt begge proteinene, sett av WF-mikroskopi.(Fig. 2a).Kolokaliseringen av de to proteinene i dråpene ble bekreftet ved konfokal (CF) mikroskopi (Supplerende Fig. 1a).Lignende oppførsel ble observert når dekstran-70 ble brukt som et aggregeringsmiddel (tilleggsfigur 1c).Ved å bruke enten FITC-merket PEG eller dekstran fant vi at begge crowding-midlene var jevnt fordelt over prøvene, og viste verken segregering eller assosiasjon (tilleggsfigur 1d).Snarere antyder det at de i dette systemet fremmer faseseparasjon gjennom makromolekylære fortrengningseffekter, siden PEG er et fortrinnsvis stabilt fortrengningsmiddel, som sett i andre LLP-systemer33,34.Disse proteinrike dråpene var følsomme for NaCl (1 M), men ikke for 1,6-HD (10 % v/v), noe som bekrefter deres elektrostatiske egenskaper (tilleggsfigur 2a, b).Deres væskeoppførsel ble bekreftet ved å observere millisekunders sammenslående dråpehendelser ved bruk av BF-mikroskopi (fig. 2b).
et konfokale (CF) mikroskopibilder av αS/Tau441-koacervater i LLPS-buffer (10 μM av hvert protein, 0,5 μM av AF488-merket αS og Atto647N-merket Tau441).b Representative DIC-bilder (differensiell interferenskontrast) av αS/Tau441 dråpefusjonshendelser (10 μM for hvert protein).c Fasediagram basert på lysspredning (ved 350 nm) av Tau441 LLPS (0–15 µM) i fravær (venstre) eller nærvær (høyre) av 50 µM αS.Varmere farger indikerer mer spredning.d Lysspredning av αS/Tau441 LLPS-prøver med økende αS-konsentrasjon (Tau441 ved 5 µM, N = 2–3 prøverepetisjoner som angitt).e Skjematisk representasjon av noen tau-proteinvarianter og forskjellige regioner av proteinet brukt i denne studien: negativt ladet N-terminalt domene (rødt), prolinrikt område (blått), mikrotubulibindende domene (MTBD, uthevet i oransje), og amyloiddannende parspiral.filamentregioner (PHF) lokalisert innenfor MTBD (grå).Netto Charge Per Residue (NCPR) kart over Tau441 vises.f Ved å bruke 1 µM AF488-merket αS og Atto647N-merket ΔNt-, ved å bruke 1 µM AF488-merket αS eller ΔCt-αS i nærvær av ΔNt-Tau (øverst, 10 µM per protein) eller µM protein per 58 (bunnen) ) ) ) mikrofotografier av WF kondensert i LLPS eller K18 buffer.Målestokkene i ett bilde representerer skalaen til alle bildene i ett panel (20 µm for panelene a, b og f).Rådata for panel c og d leveres som rådatafiler.
For å teste rollen til αS i denne LLPS-prosessen, undersøkte vi først effekten av αS på dråpestabilitet ved nefelometri ved bruk av økende konsentrasjoner av NaCl (fig. 2c).Jo høyere saltkonsentrasjon i prøvene som inneholder αS, jo høyere er lysspredningsverdiene (ved 350 nm), noe som indikerer den stabiliserende rollen til αS i dette LLPS-systemet.En lignende effekt kan observeres ved å øke αS-konsentrasjonen (og dermed αS:Tau441-forholdet) til ca.10 ganger økning i forhold til tau-konsentrasjonen (5 µM) (fig. 2d).For å demonstrere at αS er et stillasprotein i koacervater, bestemte vi oss for å undersøke oppførselen til den LLPS-forstyrrede Tau-mutanten, som mangler en negativt ladet N-terminal region (rester 1–150, se fig. 2e) kalt ΔNt-Tau.WF-mikroskopi og nefelometri bekreftet at ΔNt-Tau i seg selv ikke gjennomgikk LLPS (fig. 2f og tilleggsfig. 2d), som tidligere rapportert 14. Men når αS ble tilsatt dispersjonsløsninger av denne trunkerte Tau-varianten, var LLPS-prosessen fullstendig gjenopprettet med dråpetetthet nær dråpetettheten til løsninger i full størrelse av Tau og αS under lignende forhold og proteinkonsentrasjoner.Denne prosessen kan også observeres under forhold med lav makromolekylær trengsel (tilleggsfigur 2c).Rollen til den C-terminale αS-regionen, men ikke hele dens lengde, i LLPS-prosessen ble demonstrert ved inhibering av dråpedannelse ved bruk av en C-terminal avkortet αS-variant som mangler rester 104–140 (fig. 1a) av (ΔCt- aS) protein (fig. 2f og tilleggsfig. 2d).Kolokaliseringen av αS og ΔNt-Tau ble bekreftet ved konfokal fluorescensmikroskopi (Supplerende Fig. 1b).
For ytterligere å teste LLPS-mekanismen mellom Tau441 og αS, ble en ekstra Tau-variant brukt, nemlig det parede helical filament core (PHF) fragmentet i det mikrotubule-bindende domenet (MTBD), som hvis det inneholder fire karakteristiske gjentatte domener, vanligvis også kjent som K18-fragmentet (se fig. 2e).Det har nylig blitt rapportert at αS fortrinnsvis binder til et tau-protein lokalisert i et prolinrikt domene i en sekvens som går foran det mikrotubuli-bindende domenet.Imidlertid er PHF-regionen også rik på positivt ladede rester (se figur 2e), spesielt lysin (15 % rester), noe som fikk oss til å teste om denne regionen også bidrar til kondensasjonen av αS/Tau-komplekset.Vi observerte at K18 alene ikke kunne utløse LLPS ved konsentrasjoner opp til 100 μM under de testede betingelsene (LLPS buffer med 15% PEG eller 20% dekstran) (Figur 2f).Imidlertid, når vi tilsatte 50 µM αS til 50 µM K18, ble rask dannelse av proteindråper inneholdende K18 og αS observert ved nefelometri (tilleggsfig. 2d) og WF-mikroskopi (fig. 2f).Som forventet var ΔCt-αS ikke i stand til å gjenopprette LLPS-oppførselen til K18 (fig. 2f).Vi legger merke til at αS/K18-aggregering krever litt høyere proteinkonsentrasjoner for å indusere LLPS sammenlignet med αS/ΔNt-Tau eller αS/Tau441, alt annet like.Dette er i samsvar med en sterkere interaksjon av αS C-terminalområdet med det prolinrike Tau-domenet sammenlignet med det mikrotubuli-bindende domenet, som beskrevet tidligere 31 .
Gitt at ΔNt-Tau ikke kan utføre LLPS i fravær av αS, valgte vi denne Tau-varianten som en modell for å karakterisere αS/Tau LLPS gitt dens enkelhet i LLPS-systemer med full-lengde Tau (isotype, Tau441/Tau441).med komplekse (heterotypiske, αS/Tau441) aggregeringsprosesser.Vi sammenlignet graden av αS-aggregering (som en del av kondensert faseproteinet, fαS,c) i αS/Tau- og αS/ΔNt-Tau-systemene ved sentrifugering og dispergert fase SDS-PAGE-analyse (se 2e), fant svært like verdier for alle proteiner i samme konsentrasjon.Spesielt oppnådde vi fαS,c 84 ± 2% og 79 ± 7% for henholdsvis αS/Tau og αS/ΔNt-Tau, noe som antyder at den heterotypiske interaksjonen mellom αS og tau er overlegen interaksjonen mellom tau-molekyler.mellom.
Interaksjonen med forskjellige polykationer og effekten av kondensasjonsprosessen på αS-kinetikken ble først studert ved fluorescensgjenopprettingsmetoden etter fotobleking (FRAP).Vi testet αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau og αS/pLK koacervater (100 μM αS supplert med 2 μM αS AF488-αS og 100 μM Tau441 eller ΔNt-Tau eller 1 mM pLK).Data ble oppnådd innen de første 30 minuttene etter blanding av prøvekomponentene.Fra representative FRAP-bilder (fig. 3a, αS/Tau441-kondensering) og deres korresponderende tidsforløpskurver (fig. 3b, tilleggsfig. 3), kan det sees at αS-kinetikken er veldig lik den til Tau441-koacervater.og ΔNt-Tau, som er mye raskere med pLK.De beregnede diffusjonskoeffisientene for αS inne i koacervatet i henhold til FRAP (som beskrevet av Kang et al. 35) er D = 0,013 ± 0,009 µm2/s og D = 0,026 ± 0,008 µm2/s for αS/TauS/Δ for αS/TauS/Δ αS/-systemet.pLK, Tau og D = henholdsvis 0,18 ± 0,04 µm2/s (fig. 3c).Imidlertid er diffusjonskoeffisienten αS i den dispergerte fasen flere størrelsesordener høyere enn alle kondenserte faser, bestemt ved fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS, se tilleggsfigur 3) under de samme forholdene (LLPS buffer), men i fravær av polykationer (D = 8 ± 4 µm2/s).Derfor er kinetikken til αS-translasjon betydelig redusert i koacervater sammenlignet med proteiner i den dispergerte fasen på grunn av uttalte molekylære fortrengningseffekter, selv om alle koacervater beholder væskelignende egenskaper i løpet av den første halvtimen etter dannelsen, i motsetning til tau-fasen.raskere kinetikk i pLK-kondensat.
a–c FRAP-analyse av αS-dynamikk (2 % AF488-merket αS) i elektrostatiske koacervater.Representative bilder av αS/Tau441 FRAP-analyser i tre eksemplarer er vist i (a), der røde sirkler indikerer avfargede områder.Målestokken er 5 µm.b Gjennomsnittlige FRAP-kurver og (c) beregnede diffusjonskoeffisienter (D) for 5–6 (N) forskjellige dråper fra tre eksperimenter med 100 µM αS og ekvimolare konsentrasjoner av Tau441 (rød) eller ΔNt-Tau (blå) eller pLK (grønn) ved ti ganger konsentrasjonen av LLPS.Standardavviket til FRAP-kurven vises i skravert farge.For sammenligning ble diffusjonskoeffisienten αS i den dispergerte fasen bestemt i tre eksemplarer ved bruk av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS) (se tilleggsfigur 3 og metoder for mer informasjon).d Kontinuerlige X-bånds EPR-spektra på 100 μM TEMPOL-122-αS i LLPS-buffer uten noen polykation (svart) eller i nærvær av 100 μM Tau441 (rød) eller ΔNt-Tau (blå) eller 1 mM pLK (grønn).Innsatsen viser en forstørret visning av de sterke feltlinjene der de mest dramatiske endringene skjer.e Bindingskurver på 50 μM TEMPOL-122-αS med ulike polykationer i fravær av LLPS (ingen PEG).Den reduserte amplituden til bånd III sammenlignet med bånd II (IIII/III) av det normaliserte EPR-spekteret er vist å øke molforholdene til Tau441 (rød), ΔNt-Tau (blå) og pLK (grønn).Fargede linjer viser tilpasning til data ved å bruke en grov bindingsmodell med n identiske og uavhengige bindingssteder på hver kurve.Rådata leveres i form av rådatafiler.
Som et komplement undersøkte vi dynamikken til αS i forskjellige koacervater ved bruk av rettet spinnmerking (SDSL) og kontinuerlig elektron paramagnetisk resonans (CW-EPR).Denne metoden har vist seg å være svært nyttig for å rapportere fleksibiliteten og dynamikken til IDP med en realistisk gjenværende oppløsning36,37,38.For dette formål konstruerte vi cysteinrester i enkle Cys-mutanter og brukte 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) spinnproben.Maleimidderivater merker dem.Mer spesifikt satte vi inn TEMPOL-prober i posisjon 122 eller 24 αS (TEMPOL-122-αS og TEMPOL-24-αS).I det første tilfellet målretter vi den C-terminale regionen av proteinet, som er involvert i interaksjon med polykationer.I stedet kan posisjon 24 gi oss informasjon om den generelle dynamikken til proteinene i kondensatet.I begge tilfeller tilsvarte EPR-signalene oppnådd for proteiner i den dispergerte fasen nitroksidradikaler i rask bevegelse.Etter faseseparasjon i nærvær av tau eller pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 eller ΔNt-Tau i forholdet 1:1 eller pLK i forholdet 1:10), ble det observert en økning i den relative toppintensiteten i EPR-spekteret til αS.Tapslinjen ble utvidet, noe som indikerer redusert αS-reorienteringskinetikk i dråper sammenlignet med protein i fortynnet fase (fig. 3d, tilleggsfig. 4a).Disse endringene er mer uttalt ved posisjon 122. Mens ved posisjon 24 ikke tilstedeværelsen av pLK påvirket kinetikken til sonden, endret spektrallinjeformen seg betydelig i posisjon 122 (tilleggsfigur 4a).Da vi forsøkte å modellere spektrene i posisjon 122 til to αS/polykation-systemer ved å bruke den isotropiske modellen (tilleggsfigur 5a) som vanligvis brukes for å beskrive dynamikken til spinn-merket IDP38,39, klarte vi ikke å rekonstruere de eksperimentelle spektrene..Spektral simulering av posisjonen til 24 spinn kontraster (Supplerende Fig. 5a).Dette antyder at det er preferanseposisjoner i rommet med spinnkonfigurasjoner av den C-terminale regionen til αS i nærvær av polykationer.Når man vurderer fraksjonen av αS i den kondenserte fasen under eksperimentelle EPR-forhold (84 ± 2 %, 79 ± 7 % og 47 ± 4 % for henholdsvis αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau og αS/pLK – se tillegg Fig. 2e av dataanalyse c), kan det sees at utvidelsen detektert ved EPR-metoden hovedsakelig reflekterer interaksjonen mellom C-terminalområdet til αS med forskjellige polykationer i den kondenserte fasen (hovedendringen ved bruk av TEMPOL-122- αS), og ikke proteinkondensasjon.En økning i mikroviskositet observeres i sonden.Som forventet ble EPR-spekteret til proteinet under andre forhold enn LLPS fullstendig gjenopprettet når 1 M NaCl ble tilsatt til blandingen (tilleggsfigur 4b).Samlet sett antyder dataene våre at endringene oppdaget av CW-EPR hovedsakelig gjenspeiler interaksjonen mellom den C-terminale regionen til αS med forskjellige polykationer i den kondenserte fasen, og denne interaksjonen ser ut til å være sterkere med pLK enn med Tau.
For å få mer strukturell informasjon om proteinene i koacervatet, bestemte vi oss for å studere LLPS-systemet ved å bruke NMR i løsning.Imidlertid kunne vi bare oppdage αS-fraksjonen som er igjen i den dispergerte fasen, noe som kan skyldes redusert proteindynamikk inne i koacervatet og en tett fase i bunnen av løsningen i NMR-analyse.Da vi analyserte strukturen og dynamikken til proteinet som var igjen i den dispergerte fasen av LLPS-prøven ved bruk av NMR (Supplerende Fig. 5c, d), la vi merke til at proteinet oppførte seg nesten identisk i nærvær av pLK og ΔNt-Tau, begge av som var i sekundær struktur og dynamikk i proteinryggraden, avslørt ved eksperimenter på sekundært kjemisk skift og R1ρ-relaksasjon.NMR-data viser at C-terminalen til αS lider av et betydelig tap av konformasjonsfleksibilitet mens den beholder sin uordnede natur, som resten av proteinsekvensen, på grunn av dens interaksjoner med polykationer.
Siden CW-EPR-signalutvidelsen observert i den kondenserte TEMPOL-122-αS-fasen reflekterer interaksjonen mellom proteinet med polykationer, utførte vi en EPR-titrering for å evaluere bindingsaffiniteten til αS til forskjellige polykationer i fravær av LLPS (ingen akkumulering av Buffer LLPS), noe som tyder på at interaksjonene er de samme i fortynnede og konsentrerte faser (noe som bekreftes av våre data, tilleggsfigur 4a og tilleggsfigur 6).Målet var å se om alle koacervater, til tross for deres vanlige væskelignende egenskaper, viser noen underliggende differensiell oppførsel på molekylært nivå.Som forventet ble EPR-spekteret utvidet med økende polykationkonsentrasjon, noe som gjenspeiler en reduksjon i molekylær fleksibilitet på grunn av molekylære interaksjoner mellom alle interaksjonspartnere nesten til metning (fig. 3e, tilleggsfig. 6).pLK oppnådde denne metningen ved et lavere molforhold (polykation:αS) sammenlignet med ΔNt-Tau og Tau441.Faktisk viste sammenligning av dataene med en omtrentlig bindingsmodell som antok n identiske og uavhengige bindingsseter at den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten til pLK (~5 μM) er en størrelsesorden lavere enn for Tau441 eller ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Selv om dette er et grovt estimat, antyder dette at αS har en høyere affinitet for enklere polykationer med kontinuerlige positive ladningsområder.Gitt denne forskjellen i affinitet mellom αS og forskjellige polykationer, antok vi at deres flytende egenskaper kan endre seg forskjellig over tid og dermed lide av forskjellige LSPT-prosesser.
Gitt det svært overfylte miljøet i proteinkoacervatet og amyloidnaturen til proteinet, observerte vi oppførselen til koacervatet over tid for å oppdage mulige LSPT-prosesser.Ved å bruke BF- og CF-mikroskopi (Figur 4), observerte vi at αS/Tau441 koacerverer i stor grad i løsningen, og danner store dråper som kommer i kontakt med og fukter overflaten i bunnen av brønnen/skliet som fulle dråper, som forventet (Supplerende Fig. 7d);vi kaller disse bunnformede strukturene "proteinflåter".Disse strukturene forble flytende da de beholdt evnen til å smelte sammen (Supplerende Fig. 7b) og kunne sees i flere timer etter at LLPS ble utløst (Fig. 4 og Supplerende Fig. 7c).Vi observerte at fuktingsprosessen favoriseres på overflaten av hydrofile fremfor hydrofobe materialer (tilleggsfigur 7a), som forventet for elektrostatiske koacervater med ubalanserte ladninger og dermed høye elektrostatiske overflatepotensialer.Spesielt var αS/ΔNt-Tau-koalescens og rafting betydelig redusert, mens αS/pLK-kondensat ble betydelig redusert (fig. 4).I løpet av den korte inkubasjonstiden var αS/pLK-dråpene i stand til å koalesere og fukte den hydrofile overflaten, men denne prosessen stoppet raskt og etter 5 timers inkubering ble det kun observert begrensede koalescenshendelser og ingen fukting.– gel-drypp overgang.
Representative BF (gråskalapaneler) og CF (høyre paneler, AF488-merket αS i grønt) av koacervatprøver som inneholder 100 µM αS (1 % fluorescerende etikett) i LLPS-buffer i nærvær av 100 µM Tau441 (øverst) fluorescensbilder ΔN -Tau (senter) eller 1 mM pLK (bunn) ved forskjellige inkubasjonstider og brennhøyder (z, avstand fra bunnen av platebrønnen).Forsøkene ble gjentatt 4-6 ganger uavhengig av hverandre med samme resultater.αS/Tau441-koacervater blir fuktet etter 24 timer, og danner flåter som er større enn bildet.Målestokken for alle bilder er 20 µm.
Vi spurte deretter om de store væskelignende proteinbassengene dannet i αS/Tau441 LLPS ville føre til amyloidaggregering av noen av proteinene som ble studert.Vi fulgte modningen av αS/Tau441-dråper over tid med WF-mikroskopi under samme forhold som ovenfor, men ved bruk av 1 μM AF488-merket αS og Atto647N-merket Tau441 (fig. 5a).Som forventet observerte vi fullstendig proteinlokalisering gjennom hele modningsprosessen.Interessant nok fra ca.Etter 5 timer ble det observert mer intense ikke-sirkulære strukturer inne i flåtene, som vi kalte «punkter», hvorav noen ble kolokalisert med αS, og noen ble beriket med Tau441 (Fig. 5a, hvite piler).Disse flekkene har alltid vært observert innenfor flåter i større grad for αS/ΔNt-Tau enn for αS/ΔNt-Tau.Det var ingen distinkte flekker i dråpene til pLK- og Tau-systemer som var inkompetente for fusjon/fukting.For å teste om disse flekkene som inneholder αS og Tau441 er amyloidlignende aggregater, utførte vi et lignende eksperiment ved bruk av CF-mikroskopi der Tau441 ble merket med Atto647N og 12,5 μM amyloidspesifikk tioflavin-T (ThT) ble tilsatt fra starten.farge.Selv om ThT-farging av αS/Tau441-dråper eller flåter ikke ble observert selv etter 24 timers inkubering (fig. 5b, øverste rad – gjenværende dråper over proteinflåter), var ThT-positive strukturer som inneholdt Atto647N-Tau441 inne i flåtene svært svake.dette replikerer størrelsen, formen og plasseringen av de tidligere beskrevne flekkene (fig. 5b, midtre og nederste rader), noe som antyder at flekkene kan tilsvare amyloidlignende aggregater dannet i aldrende væskekoacervater.
WF 25 μM αS ved forskjellige inkubasjonstider og fokalhøyder (z, avstand fra ubundet bunn) i nærvær av 25 μM Tau441 (1 μM AF488-merket αS og Atto647N-merket Tau441) i en brønn på en mikroskopplate med LLPS-buffer) .Seks eksperimenter ble gjentatt uavhengig med lignende resultater.b CF mikroskopisk bilde av 25 μM αS i nærvær av 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-merket Tau441) og 12,5 μM tioflavin-T (ThT).Vektede proteindråper og avsatte proteinflåter og flekker er vist i henholdsvis øverste og midtre rad.Den nederste raden viser bilder av flåter og fall fra 3 uavhengige replikater.Hvite piler indikerer ThT-positive prikker i begge panelene.Målestokken for alle bilder er 20 µm.
For å undersøke mer detaljert endringene i koacervatproteinnettverket under overgangen fra flytende til fast stoff, brukte vi fluorescenslivstidsavbildning (FLIM) og Förster resonansenergioverføringsmikroskopi (FRET) (figur 6 og tilleggsfigurer 8 og 9).Vi antok at koacervatmodningen av laget til en mer kondensert eller til og med fast-lignende aggregert proteinstruktur fører til tettere kontakt mellom proteinet og den fluorescerende proben festet til det, og potensielt produsere en quenching-effekt manifestert i en forkortet probelevetid (τ) , som beskrevet tidligere40.,41 ,42.I tillegg, for dobbeltmerkede prøver (AF488 og Atto647N som henholdsvis FRET-donor- og akseptorfargestoffer), kan denne reduksjonen i τ også være ledsaget av koacervatkondensasjon og en økning i FRET(E)-effektivitet under LSPT.Vi overvåket flåte- og flekkdannelse over tid i LLPS αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau prøver (25 µM av hvert protein i LLPS buffer som inneholder 1 µM AF488 merket αS og/eller Atto647N merket Tau441 eller ΔNt-Tau).Vi observerte en generell trend ved at fluorescenslevetiden til AF488 (τ488) og Atto647N (τ647N)-probene avtok litt etter hvert som koacervatene modnet (fig. 6 og tilleggsfig. 8c).Interessant nok ble denne endringen betydelig forbedret for prikker i flåter (fig. 6c), noe som indikerer at ytterligere proteinkondensering skjedde ved prikker.Til støtte for dette ble det ikke observert noen signifikant endring i fluorescenslevetid for αS/ΔNt-Tau-dråper aldret i 24 timer (tilleggsfigur 8d), noe som tyder på at dråpegelering er en prosess som er forskjellig fra flekker og som ikke er ledsaget av betydelig molekylær omorganisering innenfor koacervater.Det skal bemerkes at prikkene har forskjellig størrelse og variabelt innhold i αS, spesielt for αS/Tau441-systemet (Supplerende Fig. 8e).Nedgangen i punktfluorescenslevetid ble ledsaget av en økning i intensitet, spesielt for Atto647N merket Tau441 (tillegg Fig. 8a), og høyere FRET-effektivitet for både αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau-systemer, noe som indikerer ytterligere kondensering i LLPS Fem timer etter utløsning kondenserte proteinene inne i den statiske elektrisiteten.Sammenlignet med αS/ΔNt-Tau, observerte vi lavere τ647N og noe høyere τ488-verdier i αS/Tau441-flekker, ledsaget av lavere og mer inhomogene FRET-verdier.Muligens kan dette ha sammenheng med at i αS/Tau441-systemet er den observerte og forventede αS-overfloden i aggregater mer heterogen, ofte substøkiometrisk sammenlignet med Tau, siden Tau441 i seg selv også kan gjennomgå LLPS og aggregering (Supplerende Fig. 8e) .Imidlertid er graden av dråpekoalescens, flåtedannelse og, viktigere, proteinaggregering i væskelignende koacervater maksimal når både Tau441 og αS er tilstede.
a Lifetime fluorescence microscopy (FLIM) bilder av αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau ved 25 μM av hvert protein (1 μM AF488-merket αS og 1 μM Atto647N-merket Tau441 eller ΔNtLLPSTau) i ΔNtLLPSTau.Kolonnene viser representative bilder av LLPS-prøver ved forskjellige modningstider (30 min, 5 timer og 24 timer).Den røde rammen viser regionen som inneholder αS/Tau441-flekker.Levetid vises som fargefelt.Målestokk = 20 µm for alle bilder.b Zoomet inn FLIM-bilde av det valgte området, vist i den røde boksen i panel a.Levetid vises med samme fargeskala som i panel a.Målestokk = 5 µm.c Histogrammer som viser AF488 (festet til αS) eller Atto647N (festet til Tau) for forskjellige proteinarter (dråper-D-, raft-R- og speckle-P) identifisert i FLIM-bilder tatt opp for αS-) timingfordelinger levetid for Tau441 og αS/ΔNt-Tau-koacervatprøver (N = 17-32 ROI for D, 29-44 ROI for R og 21-51 ROI for poeng).Gjennomsnitts- og medianverdier vises som henholdsvis gule firkanter og svarte linjer inne i bokser.De nedre og øvre grensene for boksen representerer henholdsvis første og tredje kvartil, og minimums- og maksimumsverdiene innenfor 1,5-fold interkvartilområdet (IQR) vises som værhår.Outliers vises som svarte diamanter.Statistisk signifikans mellom par av fordelinger ble bestemt ved å bruke en to-utvalgs t-test, forutsatt ulik varians.To-halede t-test p-verdier er vist med stjerner for hvert par sammenlignet data (* p-verdi > 0,01, ** p-verdi > 0,001, *** p-verdi > 0,0001, **** p-verdi > 0,00001), ns Indikerer neglisjerbarhet (p-verdi > 0,05).De nøyaktige p-verdiene er gitt i tilleggstabell 1, og de originale dataene presenteres som rådatafiler.
For ytterligere å demonstrere den amyloidlignende naturen til flekker/aggregater, behandlet vi ufargede koacervatprøver i 24 timer med høye konsentrasjoner av (1 M) NaCl, noe som resulterte i separasjon av aggregater fra proteinkoacervater.Når isolerte aggregater (dvs. en dispergert løsning av aggregater) ble observert ved bruk av atomkraftmikroskopi (AFM), observerte vi en overveiende sfærisk morfologi med en regulær høyde på ca. 15 nm, som har en tendens til å assosieres under forhold med høy saltkonsentrasjon, i likhet med oppførselen til typiske amyloidfibriller på grunn av den sterke hydrofobe effekten på overflaten (merk at fibriller typisk har en høyde på ~10 nm) (Supplerende Fig. 10a).Interessant nok, når isolerte aggregater ble inkubert med ThT i en standard ThT-fluorescensanalyse, observerte vi en dramatisk økning i ThT-fluorescenskvanteutbytte, sammenlignbar med det som ble observert når fargestoffet ble inkubert med typiske αS-amyloidfibriller (tilleggsfigur 10b), noe som tyder på at koacervataggregatene inneholder amyloidlignende strukturer..Faktisk var aggregatene tolerante for høye saltkonsentrasjoner, men følsomme for 4 M guanidinklorid (GdnHCl), som typiske amyloidfibriller (tilleggsfigur 10c).
Deretter analyserte vi sammensetningen av aggregatene ved å bruke enkeltmolekylfluorescens, spesifikk fluorescenskorrelasjon/kryskorrelasjonsspektroskopi (FCS/FCCS) og burstanalyse av tofarget tilfeldighetsdeteksjon (TCCD).For dette formål isolerte vi aggregater dannet etter 24 timers inkubering i 100 μl LLPS-prøver som inneholder αS og Tau441 (begge 25 μM) sammen med 1 μM AF488-merket αS og 1 μM Atto647N-merket Tau4411.Fortynn den resulterende dispergerte aggregatløsningen til en monomolekylær tilstand ved å bruke den samme PEG-frie bufferen og 1 M NaCl (den samme bufferen som brukes til å skille aggregater fra koacervat) for å forhindre eventuelle elektrostatiske interaksjoner mellom LLPS og protein.Et eksempel på tidsbanen til et enkelt molekyl kan sees i fig. 7a.FCCS/FCS-analyse (kryskorrelasjon, CC og autokorrelasjon, AC) viste at aggregater som inneholdt αS og tau var rikelig i prøvene (se CC-kurven i fig. 7b, venstre panel), og et overskudd av gjenværende monomert protein oppsto som en resultat av fortynningsprosessen (se AC-kurver i figur 7b, venstre panel).Kontrolleksperimenter utført under de samme løsningsforholdene ved bruk av prøver som kun inneholdt monomere proteiner viste ingen CC-kurver, og AC-kurvene passet godt med en-komponent diffusjonsmodellen (Eq. 4), der monomere proteiner har de forventede diffusjonskoeffisientene (fig. 7b) ), høyre panel).Diffusjonskoeffisienten til aggregerte partikler er mindre enn 1 µm2/s, og den for monomere proteiner er omtrent 1 µm2/s.50–100 µm/s;verdiene ligner tidligere publiserte verdier for sonikerte αS amyloidfibriller og monomer αS separat under lignende løsningsforhold44.Da vi analyserte aggregatene med TCCD-eksplosjonsanalyse (fig. 7c, øverste panel), fant vi at i hvert isolert aggregat (αS/Tau heteroaggregat), inneholdt ca. 60 % av de påviste aggregatene både αS og tau, ca. 30 % inneholdt kun tau, kun ca. 10 % αS.Støkiometrisk analyse av αS/Tau-heteroaggregater viste at de fleste heteroaggregatene var anriket på tau (støkiometri under 0,5, gjennomsnittlig antall tau-molekyler per aggregat er 4 ganger mer enn αS-molekyler), noe som stemmer overens med vårt arbeid observert i FLIM in situ eksperimenter..FRET-analyse viste at disse aggregatene inneholdt begge proteinene, selv om de faktiske FRET-verdiene i dette tilfellet ikke er av stor betydning, siden fordelingen av fluoroforer i hvert aggregat var tilfeldig på grunn av et overskudd av umerket protein brukt i eksperimentet.Interessant nok, da vi utførte den samme analysen ved å bruke den 45,46 modne amyloidaggregeringsmangelfulle Tau-varianten (se tilleggsfigur 11a,b), la vi merke til at selv om den elektrostatiske aS-aggregeringen var den samme (tilleggsfigur 11c, d), evnen til å danne aggregater i koacervatet ble drastisk redusert og FLIM oppdaget flere flekker i in situ eksperimenter, og svake krysskorrelasjonskurver ble observert for isolerte aggregatprøver.For et lite antall påviste aggregater (bare en tidel av Tau441), observerte vi imidlertid at hvert aggregat var anriket på αS enn denne Tau-varianten, med omtrent 50 % av de påviste aggregatene som bare inneholdt αS-molekyler, og αS var heterogent i overkant .aggregater (se tilleggsfig. 11e), i motsetning til de heterogene aggregatene generert av Tau441 (fig. 6f).Resultatene av disse eksperimentene viste at selv om αS selv er i stand til å akkumulere med tau i koacervatet, er tau-kjernedannelse mer gunstig under disse forholdene, og de resulterende amyloidlignende aggregatene er i stand til å fungere som en form for αS og tau.Imidlertid, når en tau-rik kjerne er dannet, favoriseres heterotypiske interaksjoner mellom αS og tau i aggregater fremfor homotypiske interaksjoner mellom tau-molekyler;vi observerer også proteinnettverk i flytende αS/tau-koacervater.
a Representative fluorescerende temporale spor av enkeltmolekyler av isolerte aggregater dannet i αS/Tau441 elektrostatiske koacervater.Utbrudd tilsvarende αS/Tau441-koaggregater (utbrudd over den angitte terskelen) ble observert i tre deteksjonskanaler (AF488- og Atto647N-utslipp etter direkte eksitasjon, blå og røde linjer, Atto647N-utslipp etter indirekte eksitasjon), FRET, fiolett linje).b FCS/FCCS-analyse av en prøve av isolerte αS/Tau441-aggregater hentet fra LLPS (venstre panel).Autokorrelasjons (AC) kurver for AF488 og Atto647N er vist i henholdsvis blått og rødt, og krysskorrelasjon (CC) kurver assosiert med aggregater som inneholder begge fargestoffene er vist i lilla.AC-kurvene gjenspeiler tilstedeværelsen av merkede monomere og aggregerte proteinarter, mens CC-kurvene kun viser diffusjonen av dobbeltmerkede aggregater.Den samme analysen, men under de samme løsningsforholdene som i isolerte flekker, er prøver som inneholder bare monomer αS og Tau441 vist som kontroller i høyre panel.c Fluorescensflashanalyse av enkeltmolekyler av isolerte aggregater dannet i αS/Tau441 elektrostatiske koacervater.Informasjon for hvert aggregat funnet i fire forskjellige repetisjoner (N = 152) er plottet mot deres støkiometri, S-verdier og FRET-effektivitet (øverste panel, fargelinje gjenspeiler forekomst).Tre typer aggregater kan skilles fra: -αS-bare aggregater med S~1 og FRET~0, Tau-bare aggregater med S~0 og FRET~1, og heterogene Tau/αS-aggregater med mellomliggende S og FRET Estimater av mengden av begge markørproteinene påvist i hvert heterogent aggregat (N = 100) er vist i det nedre panelet (fargeskalaen gjenspeiler forekomsten).Rådata leveres i form av rådatafiler.
Modning eller aldring av flytende proteinkondensater til gel-lignende eller faste strukturer over tid har blitt rapportert å være involvert i flere fysiologiske funksjoner til kondensatet47 så vel som i sykdom, som en unormal prosess som går foran amyloidaggregering 7, 48, 49. Her vi studerer faseseparasjon og atferd i detalj.LSPT αS i nærvær av tilfeldige polykationer i et kontrollert miljø ved lave mikromolare konsentrasjoner og fysiologisk relevante forhold (merk at den beregnede fysiologiske konsentrasjonen av αS er > 1 µM50), etter typisk termodynamisk drevet oppførsel av LPS.Vi fant at αS, som inneholder en svært negativt ladet C-terminal region ved fysiologisk pH, er i stand til å danne proteinrike dråper i vandig løsning via LLPS i nærvær av svært kationiske forstyrrede peptider som pLK eller Tau gjennom prosessen med elektrostatisk kompleks kondensasjon i nærvær av aggregeringsmakromolekyler.Denne prosessen kan ha relevante effekter i det cellulære miljøet der αS møter ulike polykationiske molekyler assosiert med dets sykdomsassosierte aggregering både in vitro og in vivo51,52,53,54.
I mange studier har proteindynamikk i dråper blitt betraktet som en av nøkkelfaktorene som bestemmer modningsprosessen55,56.I elektrostatiske αS-koacervater med polykationer avhenger modningsprosessen tilsynelatende av styrken til interaksjoner med polykationer, valensen og mangfoldet av disse interaksjonene.Likevektsteori antyder at et likevektslandskap med to flytende tilstander vil være tilstedeværelsen av en stor dråpe rik på biopolymerer som driver LLPS57,58.Dråpevekst kan oppnås ved Ostwald-modning59, koalescens60 eller forbruk av fri monomer i den dispergerte fasen61.For αS og Tau441, ΔNt-Tau eller pLK, ble det meste av proteinet konsentrert i kondensatet under forholdene brukt i denne studien.Imidlertid, mens tau-dråper i full størrelse koaleserte raskt ved overflatefukting, var dråpekoalescens og fukting vanskelig for ΔNt-Tau og pLK, noe som tyder på et raskt tap av væskeegenskaper i disse to systemene.I følge vår FLIM-FRET-analyse viste de gamle pLK- og ΔNt-Tau-dråpene en lignende grad av proteinaggregering (lignende fluorescenslevetid) som de originale dråpene, noe som tyder på at det opprinnelige proteinnettverket ble beholdt, om enn mer rigid.
Vi rasjonaliserer våre eksperimentelle resultater i følgende modell (figur 8).De opprinnelig midlertidig dannede dråpene er ofte proteinnettverk uten elektrostatisk kompensasjon, og dermed er det områder med ladningsubalanse, spesielt ved dråpegrensesnittet, noe som resulterer i dråper med et høyt elektrostatisk overflatepotensial.For å kompensere for ladning (et fenomen ofte referert til som valensutarming) og minimere overflatepotensialet til dråpene, kan dråpene inkludere nye polypeptider fra den fortynnede fasen, reorganisere proteinnettverk for å optimere ladningsladningsinteraksjoner og samhandle med andre dråper.med overflater (fukting).αS/pLK-dråpene, på grunn av deres enklere proteinnettverk (bare heterotypiske interaksjoner mellom αS og pLK) og større affinitet for protein-protein-interaksjoner, ser ut til å være i stand til å balansere ladningen til kondensatet raskere;faktisk observerte vi raskere proteinkinetikk i opprinnelig dannede αS/pLK-koacervater enn i αS/Tau.Etter valensutarming blir interaksjonene mindre flyktige og dråpene mister væskeegenskapene sine og blir til gellignende, ikke-brennbare dråper med lavt elektrostatisk overflatepotensial (og derfor ikke i stand til å fukte overflaten).I kontrast er αS/Tau-dråper mindre effektive til å optimalisere dråpeladningsbalansen på grunn av mer komplekse proteinnettverk (med både homotypiske og heterotypiske interaksjoner) og den svakere naturen til proteininteraksjoner.Dette resulterer i dråper som beholder væskeadferd i lengre perioder og viser et høyt elektrostatisk overflatepotensial som har en tendens til å bli minimert ved å koalesere og vokse (og dermed minimere overflateareal/volumforholdet til dråpene) og ved å fukte den hydrofile overflatekjemikalien.Dette skaper store konsentrerte proteinbiblioteker som beholder væskeegenskaper da interaksjonene forblir svært forbigående på grunn av det konstante søket etter ladningsoptimalisering i proteinnettverket.Interessant nok viser N-terminalt trunkerte former av Tau, inkludert noen naturlig forekommende isoformer62, middels oppførsel, med noen koacervater som eldes med αS til langlivede gellignende dråper, mens andre forvandles til store flytende kondensater.Denne dualiteten i modningen av αS elektrostatiske koacervater er i samsvar med nyere LLPS-teoretiske og eksperimentelle studier som har identifisert en korrelasjon mellom valensutarming og elektrostatisk sikting i kondensat som en nøkkel til å kontrollere kondensatstørrelse og væskeegenskaper.Mekanisme 58,61.
Dette skjemaet viser den antatte amyloidaggregeringsveien for αS og Tau441 via LLPS og LSPT.Med ytterligere anionrike (røde) og kationrike (blå) regioner, har αS og tau elektrostatiske koacervater med tilfredsstillende valens lavere overflateenergi og derfor mindre koalescens, noe som resulterer i rask dråpealdring.En stabil ikke-agglomerert geltilstand oppnås..Denne situasjonen er veldig gunstig i tilfellet med αS/pLK-systemet på grunn av dets høyere affinitet og enklere protein-par-interaksjonsnettverk, som muliggjør en rask gel-lignende overgang.Tvert imot, dråper med utilfredsstillende valens og derfor proteinladede områder tilgjengelig for interaksjon, gjør det lettere for koacervatet å smelte sammen og fukte den hydrofile overflaten for å redusere dens høye overflateenergi.Denne situasjonen er å foretrekke for αS/Tau441-koacervater, som har et multivalent komplekst nettverk bestående av svake Tau-Tau- og αS-Tau-interaksjoner.I sin tur vil større koacervater lettere beholde sine væskelignende egenskaper, slik at andre protein-til-protein-interaksjoner kan oppstå.Til slutt dannes amyloide heterogene aggregater som inneholder både αS og tau i koacervatvæsken, som kan være relatert til de som finnes i inklusjonskropper, som er kjennetegn ved nevrodegenerative sykdommer.
De store væskelignende strukturene som dannes under modning av αS/Tau441 med et svært overbelastet, men dynamisk proteinmiljø og, i mindre grad, αS/ΔNt-Tau-koacervater er ideelle reservoarer for kjernedannelse av proteinaggregering.Vi har faktisk observert dannelsen av faste proteinaggregater i denne typen proteinkoacervater, som ofte inneholder både αS og tau.Vi har vist at disse heteroaggregatene er stabilisert av ikke-elektrostatiske interaksjoner, er i stand til å binde amyloidspesifikke ThT-fargestoffer på samme måte som typiske amyloidfibriller, og faktisk har lignende motstand mot ulike påvirkninger.αS/tau-aggregatene dannet av LLPS ble vist å ha amyloidlignende egenskaper.Faktisk er den modne varianten av Tau med mangel på amyloidaggregering betydelig svekket i dannelsen av disse heterogene αS-aggregatene i det flytende elektrostatiske koacervatet.Dannelsen av αS/Tau441-aggregater ble kun observert inne i koacervatene, som beholdt væskelignende egenskaper, og aldri, hvis koacervatene/dråpene ikke nådde geltilstanden.I sistnevnte tilfelle forhindrer den økte styrken til elektrostatiske interaksjoner og, som et resultat, stivheten til proteinnettverket de nødvendige konformasjonsomorganiseringene av proteiner for å etablere nye proteininteraksjoner som er nødvendige for amyloidkjernedannelse.Dette kan imidlertid oppnås i mer fleksible, væskelignende koacervater, som igjen er mer sannsynlig å forbli flytende når de øker i størrelse.
Det faktum at dannelsen av aggregater i den kondenserte fasen er å foretrekke i store αS/Tau-kondensat enn i små dråper som raskt gelerer, fremhever relevansen av å identifisere faktorene som kontrollerer dråpekoalescens.Dermed er det ikke bare en tendens til faseseparasjon, men størrelsen på kondensatet må kontrolleres for riktig funksjon samt sykdomsforebygging58,61.Resultatene våre fremhever også viktigheten av balansen mellom LLPS og LSPT for αS/Tau-systemet.Mens dråpedannelse kan beskytte mot amyloidaggregering ved å redusere mengden av proteinmonomerer tilgjengelig under metningsforhold, som det har blitt foreslått i andre systemer63,64, kan dråpefusjon ved høye dråpenivåer føre til intern proteinaggregering gjennom langsomme konformasjonsrearrangementer.proteinnettverk..
Samlet sett understreker dataene våre sterkt relevansen av sammenhengende valens og tilfredse/utilfredse interaksjoner i drop-nettverk i sammenheng med LSPT.Spesielt viser vi at αS/Tau441-kondensater i full lengde er i stand til å effektivt smelte sammen og danne amyloidlignende heteroaggregater som inkluderer begge proteiner og foreslår en molekylær mekanisme basert på våre eksperimentelle resultater.Koaggregeringen av to proteiner i αS/Tau-væskekoacervatet som vi rapporterer her kan faktisk være relatert til samlokalisering av to proteiner i inklusjoner, som er kjennetegn på sykdommen, og kan bidra til å forstå sammenhengen mellom LLPS og amyloidaggregering, og baner vei for høyt ladet IDP ved nevrodegenerasjon.
Monomere WT-αS, cysteinmutanter (Q24C-αS, N122C-αS) og ΔCt-αS varianter (Δ101-140) ble uttrykt i E. coli og renset som tidligere beskrevet.5 mM DTT ble inkludert i alle trinn i rensingen av αS-cysteinmutanter for å forhindre dannelse av disulfidbindinger.Tau441 isoform (plasmid hentet fra Addgene #16316), ΔNt-Tau-variant (Δ1–150, oppnådd ved kloning av IVA med primere CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) og AggDef-1CT-variant – 1CT-5C renset med EGGDef-1CT5C-variant. coli-kulturer var dyrket til OD600 = 0,6–0,7 ved 37 °C og 180 rpm, og ekspresjon ble indusert med IPTG i 3 timer ved 37 °C.Høst celler ved 11 500 xg i 15 minutter ved 4 ° C og vask med saltvannsbuffer som inneholder 150 mM NaCl.Resuspender pelleten i lyseringsbuffer (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, copeptin 100).Sonikeringstrinnet ble utført på is med en amplitude på 80 % i 10 pulser (1 min på, 1 min av).Ikke overskrid 60 ml i en ultralyd.E. coli lysater ble oppvarmet ved 95°C i 20 minutter, deretter avkjølt på is og sentrifugert ved 127 000 xg i 40 minutter.Den klarede supernatanten ble påført en 3,5 kDa membran (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) og dialysert mot 4 L dialysebuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM PMSF 0,1 mM) i 10 timer.En 5 ml kationbytterkolonne (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ble ekvilibrert med ekvilibreringsbuffer (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau-lysatet ble filtrert gjennom et 0,22 μm PVDF-filter og injisert i kolonnen med en strømningshastighet på 1 ml/min.Eluering ble utført gradvis, tau ble eluert med 15–30 % elueringsbuffer (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE, og eventuelle fraksjoner som inneholdt ett bånd med forventet molekylvekt av tau ble konsentrert ved bruk av et 10 kDa sentrifugefilter og erstattet med en buffer inneholdende 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM og DTT 2 mM for den endelige proteinkonsentrasjonen var 100 μM.Proteinløsningen ble deretter ført gjennom et 0,22 μm PVDF-filter, raskt frosset og lagret ved -80°C.Protein K18 ble levert av prof. Alberto Boffi.Renheten til preparatet var >95 % som bekreftet av SDS-PAGE og MALDI-TOF/TOF.Ulike cysteiner ble kjemisk merket med AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) eller TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).ble bekreftet ved absorbans og MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau og K18 ble merket med native cysteinrester i posisjonene 191 og 322 ved bruk av Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Tyskland) etter samme prosedyre.Netto ladning per rest-kart for αS og Tau441 ble generert ved bruk av CIDER66.
Fast poly-L-lysin (pLK DP 90-110 i henhold til NMR fra leverandør, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ble oppløst i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 til 10 mM konsentrasjon, prosess sonikert i 5 minutter i et ultralydvannbad og oppbevar ved -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) og FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) er vannløselige og spredt i LLPS-buffer.Dialyse fjerner forurensende salter.De ble deretter filtrert gjennom et sprøytefilter med en porestørrelse på 0,22 μm, og konsentrasjonene deres ble beregnet ved hjelp av et refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS-prøver ble fremstilt ved romtemperatur i følgende rekkefølge: buffer og ekstrudering ble blandet og 1 mM tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, Storbritannia), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1,2-diyldinitril) tetraeddiksyre (EDTA, karboksynth) og en blanding av 1 % proteasehemmer (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Deretter tilsettes αS og smeltede polykationer (alternativer pLK eller Tau).For tioflavin-T-tidsserieeksperimenter (ThT, Carbosynth, Compton, Storbritannia), bruk den totale ThT-konsentrasjonen til å være halvparten av αS-konsentrasjonen.Bland prøvene forsiktig men grundig for å sikre at de er homogene.Konsentrasjonen av hver komponent varierte fra eksperiment til eksperiment, som beskrevet i resultatdelen.Azid ble brukt i en konsentrasjon på 0,02 % (vekt/volum) når varigheten av eksperimentet oversteg 4 timer.For alle analyser som bruker LLPS-prøver, la blandingen komme i likevekt i 5 minutter før analyse.For lysspredningsanalyse ble 150 µl prøver lastet på ikke-bindende 96-brønners mikroplater (µClear®, svart, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Østerrike) og dekket med klebende film.LLP-er ble overvåket ved å måle absorbans ved 350 nm i midten av løsningen i en CLARIOstar plateleser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).Forsøkene ble utført i tre eksemplarer ved 25°C, og feilene ble beregnet som standardavvik fra gjennomsnittet.Den fortynnede fasen ble kvantifisert ved prøvesentrifugering og SDS-PAGE-gelanalyse, og αS-fraksjonen i den fortynnede og konsentrerte fasen ble kvantifisert i forskjellige LLPS-løsninger.En 100 μl LLPS-prøve inneholdende 1 μM AF488-merket αS ble fremstilt ved grundig blanding etterfulgt av sentrifugering ved 9600×g i 30 minutter, hvoretter bunnfallet vanligvis var synlig.De øverste 50 μl av supernatanten ble brukt til proteinkvantifisering ved bruk av SDS-PAGE-gel.Geler ble skannet med AF488-filtre ved bruk av et ChemiDoc-gelbildesystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eller farget med Coomassie-farge og visualisert med passende filtre.De resulterende båndene ble analysert ved bruk av ImageJ versjon 1.53i (National Institutes of Health, USA).Eksperimentene ble utført i duplikat i to forskjellige forsøk med lignende resultater.
Vanligvis ble 150 μl prøver påført på ikke-bindende 96-brønners mikroplater og visualisert ved romtemperatur på et Leica DMI6000B invertert mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).For punkteksperimenter ble µ-Slide angiogenese-plater (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) eller 96-brønners polystyren-mikroplater (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) også brukt.EL6000 halogen- eller kvikksølvmetallhalogenlamper ble brukt som belysningskilder (for henholdsvis BF/DIC og WF-avbildning).For WF-mikroskopi ble et luftobjektiv med 40x forstørrelse (Leica Microsystems, Tyskland) brukt for å fokusere lyset på prøven og samle det.For AF488- og ThT-merkede prøver, filtereksitasjon og emisjon med standard GFP-filtersett, eksitasjons- og emisjonsbåndpassfiltre, henholdsvis 460–500 nm og 512–542 nm båndpassfiltre, og et 495 nm dikroisk speil.For prøver merket med Atto647N ble det brukt et standardsett med Cy5-filtre med eksitasjons- og emisjonsbåndpassfiltre 628–40 nm og 692–40 nm, og et 660 nm dikroisk speil.For BF- og DIC-mikroskopi, bruk det samme reflekterte lysoppsamlingsobjektivet.Det oppsamlede lyset ble tatt opp på et Leica DFC7000 CCD-kamera (Leica Microsystems, Tyskland).Eksponeringstiden var 50 ms for BF- og DIC-mikroskopiavbildning og 20-100 ms for WF-mikroskopiavbildning.Til sammenligning var eksponeringstiden for alle eksperimenter med ThT 100 ms.Time-lapse-eksperimenter ble utført for å visualisere dråpesammenslåing, med bilder som ble samlet inn hver 100 ms i flere minutter.ImageJ (NIH, USA) ble brukt til bildeanalyse.Eksperimentene ble utført i tre eksemplarer med lignende resultater.
For kolokaliseringseksperimenter, FRAP og 3D-rekonstruksjon ble bilder tatt på et Zeiss LSM 880 invertert konfokalmikroskop ved bruk av en ZEN 2 blå utgave (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).Prøver på 50 µl ble påført µ-Slide Angiogenesis Petriskåler (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Tyskland), behandlet med en hydrofil polymer (ibiTreat) og montert i et 63× oljeneddykkingsobjektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) på DIC).Bilder ble tatt med 458 nm, 488 nm og 633 nm argon-laserlinjer med en oppløsning på 0,26 µm/piksel og en eksponeringstid på 8 µs/piksel for eksitasjons- og emisjonsdeteksjonsvinduer på 470–600 nm, 493–6 nm, 6 og 638–755 nm ble brukt til å visualisere henholdsvis ThT, AF488 og Atto647N.For FRAP-eksperimentene ble time-lapse-fotografering av hver prøve tatt opp med 1 bilde per sekund.Forsøkene ble utført i tre eksemplarer ved romtemperatur med lignende resultater.Alle bildene ble analysert ved hjelp av Zen 2 blue edition-programvare (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).FRAP-kurvene ble normalisert, plottet og tilpasset intensitets-/tidsdata hentet fra bilder ved bruk av Zen 2 ved bruk av OriginPro 9.1.Utvinningskurvene ble tilpasset en mono-eksponentiell modell for å ta hensyn til molekylær diffusjon med en ekstra eksponentiell term for å gjøre rede for oppkjøpsblekeeffekten.Vi beregnet deretter D ved å bruke den nominelle blekeradiusen og den tidligere bestemte utvinningshalveringstiden som i ligningen til Kang et al.5 35 vist.
Enkelte cysteinvarianter av αS ble syntetisert med 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oksyl (TEMPOL) i posisjonene 24 (TEMPOL-24-αS) og 122 (TEMPOL-122-αS), hhv.Spinnmerking For EPR-eksperimenter ble αS-konsentrasjonen satt til 100 μM og PEG-konsentrasjonen var 15 % (vekt/volum).For ulike aggregeringsforhold var αS:pLK-forholdet 1:10, mens αS:ΔNt-Tau- og αS:Tau441-forholdet ble opprettholdt på 1:1.For bindingstitreringseksperimenter i fravær av trengsel, ble TEMPOL-122-αS opprettholdt ved 50 μM og polykationer ble titrert ved økende konsentrasjoner, og hver tilstand ble forberedt separat.CW-EPR-målinger ble utført ved bruk av et Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometer utstyrt med en Bruker ER4118 SPT-N1 resonator som opererer ved en mikrobølge (SHF) frekvens på ~9,7 GHz.Temperaturen ble satt til 25°C og kontrollert av en flytende nitrogenkryostat.Spektrene ble oppnådd under umettede forhold ved en MW-effekt på 4 mW, en modulasjonsamplitude på 0,1 mT og en modulasjonsfrekvens på 100 kHz.Spektralintensiteter ble normalisert for å unngå forskjeller i spinnkonsentrasjoner mellom prøver og mulig spinnreduksjon på grunn av gjenværende konsentrasjoner av reduksjonsmidler i prøver som inneholder Tau441 eller ΔNt-Tau (tilstede i de originale proteinløsningene).De gitte verdiene for g ble oppnådd som et resultat av EPR-spektralmodellering utført ved bruk av Easyspin-programvaren (v. 6.0.0-dev.34) implementert i Matlab®67.En/to-komponent isotrope modeller ble brukt til å modellere dataene.Etter normalisering av alle signaler, ble residualene beregnet ved å trekke hver simulering fra det tilsvarende eksperimentelle spekteret.For bindingstitreringsanalyse ble den relative intensiteten av det tredje båndet til det andre båndet av det normaliserte EPR-spekteret (IIII/III) brukt for å overvåke bindingen av polykationer til αS.For å estimere dissosiasjonskonstanten (Kd), ble den resulterende kurven tilpasset til en omtrentlig modell som antok n identiske og uavhengige bindingsseter.
NMR-spektroskopi-eksperimenter ble utført ved bruk av et Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektrometer utstyrt med en kryoprobe og Z-gradient.Alle eksperimenter ble utført ved bruk av 130–207 µM αS og tilsvarende αS/ΔNt-Tau og pLK-ekvivalenter i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 og ble utført ved 15 °C.For å overvåke LPS ved NMR, ble 10 % PEG tilsatt til de forhåndsblandede prøvene.Det kjemiske skift-forstyrrelsesplottet (Fig. 1b) viser gjennomsnittlige 1H og 15N kjemiske skift.αS 2D1H-15N HSQC-spektrene ble tildelt basert på en tidligere tildeling (BMRB-oppføring #25227) og bekreftet ved å registrere og analysere 3D-spektrene til HNCA, HNCO og CBCAcoNH.13Cα og 13Cβ kjemiske skift ble beregnet i nærvær av ΔNt-Tau eller pLK for å måle mulige endringer i sekundære strukturtrender sammenlignet med αS kjemiske skift i ren tilfeldig spolekonformasjon 68 (tilleggsfigur 5c).R1ρ-hastighetene ble målt ved å registrere hsqctretf3gpsi-eksperimenter (hentet fra Bruker-biblioteket) med forsinkelser på 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 og 800 ms, og de eksponentielle funksjonene ble justert til forsinkelsene ved forskjellig intensitet. ganger for å bestemme R1ρ og dens eksperimentelle usikkerhet.
To-farge tidsoppløst fluorescensmikroskopi-eksperimenter ble utført på et kommersielt tidsoppløst MT200 fluorescens konfokalt mikroskop (PicoQuant, Berlin, Tyskland) med en tidskorrelert enkeltfotontelling (TCSPC) enhet.Laserdiodehodet brukes til pulsert interleaved eksitasjon (PIE), strålen passerer gjennom en enkeltmodusbølgeleder og er innstilt til en lasereffekt på 10 til 100 nW for 481 nm og 637 nm laserlinjer målt etter et dikroisk speil.Dette sikrer en optimal foton-tellehastighet, og unngår effekten av fotonaliasing, fotobleking og metning.μ-Slide angiogenese dekkglass eller plater (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) ble plassert direkte i nedsenkingsvann over en Super Apochromat 60x NA 1.2 linse med korrigerende krage (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Et 488/640 nm dikroisk speil (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ble brukt som hovedstråledeler.Ufokusert stråling blokkeres av et hull med en diameter på 50 mikron, deretter deles den fokuserte strålingen inn i 2 deteksjonsbaner av en 50/50 stråledeler.Båndpass emisjonsfiltre (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 for grønt fargestoff (AF488) og 690/70 for rødt fargestoff (Atto647N) ble brukt foran detektoren.Enkeltfoton skreddioder (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) ble brukt som detektorer.Både datainnsamling og analyse ble utført ved bruk av den kommersielt tilgjengelige SymphoTime64-programvaren (PicoQuant GmbH, Berlin, Tyskland).
Femti mikroliter LLPS-prøver ble påført μ-Slide angiogenesebrønner (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland).De resulterende bildene er fokusert til 20 µm over brønnbunnen for optimal objektiv arbeidsavstand for suspenderte dråper og til ~1 µm for flåter og prikker med en aksial oppløsning på minst 0,25 µm/piksel og en forsinkelsestid på 400 µs/piksel.Velg data ved å bruke en intensitetsterskel basert på gjennomsnittlig bakgrunnssignalintensitet (PBG, gjennomsnitt + 2σ) for hver kanal, slik at bare flytende proteindråper, flåter eller flekker velges, og filtrerer ut enhver mulig opprinnelse fra den dispergerte fasen.For å analysere levetiden til hver art (τ) av hver kanal (grønn, "g" for AF488 og rød, "r" for Atto647N), valgte vi regioner av interesse (ROIer) som inneholder dråper, flåter eller flekker (tilleggsfigur 1) ).8b) og utledet dem ved å tilpasse deres livstidsforfall (τD, τR og τP for henholdsvis dråper, flåter eller flekker, se tilleggsfigur 8c) i hver kanal ved å bruke en haletilpasningsanalyse og en to-komponents forfallsmodell.Gjennomsnittlig τ fra τ .ROIer som produserte for få fotoner for en multi-eksponentiell tilpasning ble ekskludert fra analysen.Cutoff som ble brukt var <104 fotoner for flåter og prikker og 103 for fall.Dråpene har en lavere terskel fordi det er vanskelig å oppnå henfallskurver med høyere intensitetsverdier, siden dråpene i bildefeltet vanligvis er mindre og mindre tallrike.ROIer med fotontellinger over fotonakkumuleringsgrensen (sett til >500 tellinger/piksel) ble også forkastet for analyse.Tilpass intensitetsdempningskurven oppnådd fra området av interesse med en intensitet på 90 % av maksimum (litt etter maksimal intensitet av forfallet) fra begynnelsen av levetiden for å sikre minimal IRF-interferens samtidig som den samme opprettholdes for all intensitetsnedgang innstillinger Relativt tidsvindu Ble analysert 25 til 50 ROI for flåter og spots og 15-25 ROI for drops, bilder valgt fra mer enn 4 replikater tatt opp fra minst 3 uavhengige eksperimenter.To-halede t-tester har blitt brukt for å evaluere statistiske forskjeller mellom arter eller mellom koacervatsystemer.For en piksel-for-piksel-analyse av levetiden (τ), ble den totale dempningen av levetiden over feltet for hver kanal beregnet og en tilnærming av en 2/3-komponent eksponentiell dempningsmodell ble utført.Levetidsdempningen for hver piksel ble deretter tilpasset ved å bruke tidligere beregnede τ-verdier, noe som resulterte i et pseudofarget FLIM-tilpasningsbilde.Haletilpasningens levetid var den samme på tvers av alle bilder av samme kanal, og hvert forfall produserte nok fotoner til å gi en pålitelig passform.For FRET-analyse ble piksler valgt ved å bruke en lavere intensitetsterskel på 100 fotoner, som gjennomsnitt et bakgrunnssignal (FBG) på 11 fotoner.Fluorescensintensiteten til hver kanal ble korrigert med eksperimentelt bestemte korreksjonsfaktorer: 69 spektral krysstale α var 0,004, direkte eksitasjon β var 0,0305, deteksjonseffektivitet γ var 0,517.FRET-effektiviteten på pikselnivå beregnes deretter ved å bruke følgende ligning:
der FDD er fluorescensintensiteten observert i donorkanalen (grønn), FDA er fluorescensintensiteten observert i akseptorkanalen (rød) under indirekte eksitasjon, og FAA er fluorescensintensiteten observert i akseptorkanalen (rød) under direkte eksitasjon ( PAI).Fluorescensintensitetspulser observeres i kanalen).
Plasser 100 µl LLPS-reaksjonsløsninger som inneholder 25 µM umerket monomer Tau441 (med eller uten 25 µM αS) i LLPS-buffer (supplert som ovenfor) på ikke-bindende 96-brønners mikroplater med klebende foliebelegg og dråpedannelse ble kontrollert med WF-mikroskopi. ekvilibrering.innen 10 min.Etter 48 timers inkubasjon ved romtemperatur ble tilstedeværelsen av proteinflåter og flekker bekreftet.Fjern deretter væsken forsiktig over flåtene fra brønnene, tilsett deretter 50 L dissosiasjonsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) og inkuber i 10 min.Den høye saltkonsentrasjonen sikrer at LLPS ikke vil gjenta seg på grunn av gjenværende PEG, og mulige proteinsammenstillinger dannet kun ved elektrostatiske interaksjoner vil bli demontert.Bunnen av brønnen ble deretter forsiktig skrapet av med en mikropipettespiss og den resulterende løsningen ble overført til en tom observasjonsbrønn.Etter inkubering av prøvene med 50 μM ThT i 1 time, ble tilstedeværelsen av isolerte flekker kontrollert med WF-mikroskopi.Forbered sonikerte αS-fibriller ved å inkubere 300 µl av en 70-µM αS-løsning i PBS med pH 7,4, natriumazid 0,01 % ved 37 °C og 200 rpm på en orbital shaker i 7 dager.Løsningen ble deretter sentrifugert ved 9600×g i 30 minutter, pelleten ble resuspendert i PBS pH 7,4 og sonikert (1 min, 50 % syklus, 80 % amplitude i en Vibra-Cell VC130 sonikerer, Sonics, Newton, USA) fibrilprøver med en relativt jevn størrelsesfordeling av små fibriller.
FCS/FCCS-analyse og tofargesammenfallsdeteksjon (TCCD) ble utført på det samme MT200-tidsoppløste fluorescerende konfokalmikroskopet (Pico-Quant, Berlin, Tyskland) som ble brukt for FLIM-FRET-mikroskopieksperimentene ved bruk av PIE-modus.Lasereffekten for disse eksperimentene ble lagt til 6,0 µW (481 nm) og 6,2 µW (637 nm).Kombinasjonen av disse laserkreftene ble valgt for å produsere lignende lysstyrke for parene med fluoroforer som ble brukt, samtidig som man oppnådde optimale tellehastigheter og unngår fotobleking og metning.Både datainnsamling og analyse ble utført ved bruk av den kommersielt tilgjengelige SymphoTime64 versjon 2.3-programvaren (PicoQuant, Berlin, Tyskland).
Prøver av isolerte αS/Tau-aggregater oppnådd ved bruk av LLPS fortynnes i isolasjonsbuffer til passende monomolekylær konsentrasjon (typisk en 1:500 fortynning, siden aggregater allerede er i lave konsentrasjoner når de isoleres fra koacervatprøver).Prøver ble påført direkte på dekkglass (Corning, USA) forhåndsbelagt med en BSA-løsning i en konsentrasjon på 1 mg/ml.
For PIE-smFRET-analysen i de grønne og røde kanalene ble en lavere intensitetsterskel på 25 fotoner brukt for å filtrere ut lavintensitetssignaler forårsaket av monomere hendelser (merk at monomerer overgår aggregerte prøver sammenlignet med isolerte aggregater).Denne terskelen ble beregnet som fem ganger den gjennomsnittlige intensiteten av monomert αS oppnådd fra analysen av rene monomerprøver for å spesifikt velge aggregater for analyse.PIE-drivkretsen, sammen med TSCPC-datainnsamling, har muliggjort bruken av et livstidsvektingsfilter som hjelper til med å eliminere bakgrunn og spektral krysstale.Oppblussintensiteten valgt ved hjelp av terskelverdiene ovenfor ble korrigert ved å bruke det gjennomsnittlige bakgrunnssignalet bestemt fra histogrammene for forekomst versus intensitet/bin av prøvene som kun inneholder buffer.Bursts assosiert med store aggregater opptar vanligvis flere påfølgende hyller i tidssporet (sett til 1 ms).I disse tilfellene ble en bøtte med maksimal styrke valgt.For FRET og støkiometrisk analyse ble den teoretisk bestemte gammafaktoren γ (0,517) brukt.Spektral krysstale og direkte eksitasjonsbidrag er ubetydelige (bestemt eksperimentelt) ved eksitasjonslaserkraften som brukes.Effektiviteten og støkiometrien til FRET i en eksplosjon beregnes som følger.