Takk for at du besøker Nature.com.Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Skyveknapper som viser tre artikler per lysbilde.Bruk tilbake- og neste-knappene for å gå gjennom lysbildene, eller lysbildekontrollknappene på slutten for å gå gjennom hvert lysbilde.

317 Leverandører av spiralrør i rustfritt stål

Kjemisk sammensetningstabell av rustfritt stålmateriale

SPACA6 er et sperm-uttrykt overflateprotein som er kritisk for kjønnscellefusjon under seksuell reproduksjon av pattedyr.Til tross for denne grunnleggende rollen, er den spesifikke funksjonen til SPACA6 dårlig forstått.Vi belyser krystallstrukturen til det ekstracellulære domenet til SPACA6 med en oppløsning på 2,2 Å, og avslører et to-domene protein sammensatt av en fire-trådet bunt og Ig-lignende β-smørbrød forbundet med kvasifleksible linkere.Denne strukturen ligner IZUMO1, et annet gametfusjonsassosiert protein, noe som gjør SPACA6 og IZUMO1 grunnleggende medlemmer av superfamilien av befruktningsassosierte proteiner referert til her som IST-superfamilien.IST-superfamilien er strukturelt definert av dens vridde fire-helix-bunt og et par disulfid-koblede CXXC-motiver.Et strukturbasert AlphaFold-søk av det menneskelige proteomet identifiserte ytterligere proteinmedlemmer av denne superfamilien;spesielt er mange av disse proteinene involvert i gametfusjon.SPACA6-strukturen og dens forhold til andre medlemmer av IST-superfamilien gir den manglende lenken i vår kunnskap om pattedyr-gametefusjon.
Hvert menneskeliv begynner med to separate haploide kjønnsceller: farens sæd og mors egg.Denne sædcellen er vinneren av en intens seleksjonsprosess der millioner av sædceller passerer gjennom den kvinnelige kjønnskanalen, overvinner ulike hindringer1 og gjennomgår kapasitering, noe som forbedrer deres motilitet og prosessen med overflatekomponenter2,3,4.Selv om sædcellene og oocytten finner hverandre, er ikke prosessen over ennå.Oocytten er omgitt av et lag med cumulusceller og en glykoproteinbarriere kalt zona pellucida, som sædceller må passere gjennom for å komme inn i oocytten.Spermatozoer bruker en kombinasjon av overflateadhesjonsmolekyler og membranassosierte og utskilte enzymer for å overvinne disse endelige barrierene5.Disse molekylene og enzymene er hovedsakelig lagret i den indre membranen og den akrosomale matrisen og oppdages når den ytre membranen til sædcellene lyseres under den akrosomale reaksjonen6.Det siste trinnet i denne intense reisen er sperm-egg-fusjonshendelsen, der de to cellene smelter sammen membranene sine til å bli en enkelt diploid organisme7.Selv om denne prosessen er banebrytende i menneskelig reproduksjon, er de nødvendige molekylære interaksjonene dårlig forstått.
I tillegg til befruktning av kjønnsceller, har kjemien til fusjonen av to lipid-dobbeltlag blitt grundig studert.Generelt er membranfusjon en energisk ugunstig prosess som krever at en proteinkatalysator gjennomgår en strukturell konformasjonsendring som bringer to membraner nærmere hverandre, bryter deres kontinuitet og forårsaker fusjon8,9.Disse proteinkatalysatorene er kjent som fusogener og har blitt funnet i utallige fusjonssystemer.De er nødvendige for virusinntrengning i vertsceller (f.eks. gp160 i HIV-1, topp i koronavirus, hemagglutinin i influensavirus)10,11,12 placenta (syncytin)13,14,15 og kjønnsceller-dannende fusjoner i nedre eukaryoter ( HAP2/GCS1 i planter, protister og leddyr) 16,17,18,19.Fusogener for menneskelige kjønnsceller har ennå ikke blitt oppdaget, selv om flere proteiner har vist seg å være kritiske for kjønnscellebinding og fusjon.Den oocyttuttrykte CD9, et transmembranprotein som kreves for fusjon av mus og menneskelige gameter, var den første som ble oppdaget 21,22,23.Selv om dens nøyaktige funksjon forblir uklar, virker en rolle i adhesjon, strukturen til adhesjonsfokus på eggmikrovilli og/eller korrekt lokalisering av oocyttoverflateproteiner sannsynlig 24,25,26.De to mest typiske proteinene som er kritiske for kjønnscellefusjon er sædproteinet IZUMO127 og oocyttproteinet JUNO28, og deres gjensidige assosiasjon er et viktig skritt i kjønnscellegjenkjenning og adhesjon før fusjon.Izumo1 knockout hannmus og Juno knockout hunnmus er fullstendig sterile, i disse modellene kommer sædceller inn i perivitellinerommet, men kjønnsceller smelter ikke sammen.Tilsvarende ble konfluens redusert når kjønnsceller ble behandlet med anti-IZUMO1- eller JUNO27,29-antistoffer i humane in vitro-fertiliseringsforsøk.
Nylig er det oppdaget en nyoppdaget gruppe sperm-uttrykte proteiner som er fenotypisk lik IZUMO1 og JUNO20,30,31,32,33,34,35.Sperm akrosomalt membran-assosiert protein 6 (SPACA6) har blitt identifisert som essensielt for befruktning i en storskala murin mutagenesestudie.Innsetting av transgenet i Spaca6-genet produserer ikke-smeltbare spermatozoer, selv om disse spermatozoene infiltrerer perivitellinerommet 36 .Påfølgende knockout-studier på mus bekreftet at Spaca6 er nødvendig for kjønnscellefusjon 30,32.SPACA6 uttrykkes nesten utelukkende i testiklene og har et lokaliseringsmønster som ligner det til IZUMO1, nemlig innenfor intima til spermatozoene før den akrosomale reaksjonen, og migrerer deretter til ekvatorialregionen etter den akrosomale reaksjonen 30,32.Spaca6-homologer eksisterer i en rekke pattedyr og andre eukaryoter 30 , og dens betydning for human kjønnscellefusjon har blitt demonstrert ved inhibering av human befruktning in vitro ved resistens mot SPACA6 30 .I motsetning til IZUMO1 og JUNO forblir detaljene i strukturen, interaksjonene og funksjonen til SPACA6 uklare.
For å bedre forstå den grunnleggende prosessen som ligger til grunn for fusjonen av menneskelig sæd og egg, som vil gjøre oss i stand til å informere om fremtidig utvikling innen familieplanlegging og fertilitetsbehandling, gjennomførte vi SPACA6 strukturelle og biokjemiske studier.Krystallstrukturen til det ekstracellulære domenet til SPACA6 viser en fire-helikal bunt (4HB) og et immunglobulinlignende (Ig-lignende) domene forbundet med kvasifleksible regioner.Som forutsagt i tidligere studier, 7,32,37 er domenestrukturen til SPACA6 lik den til human IZUMO1, og de to proteinene deler et uvanlig motiv: 4HB med en trekantet spiralformet overflate og et par disulfidkoblede CXXC-motiver.Vi foreslår at IZUMO1 og SPACA6 nå definerer en større, strukturelt beslektet superfamilie av proteiner assosiert med gametefusjon.Ved å bruke funksjoner som er unike for superfamilien, gjennomførte vi et uttømmende søk etter det strukturelle menneskelige proteomet AlphaFold, og identifiserte flere medlemmer av denne superfamilien, inkludert flere medlemmer involvert i gametfusjon og/eller befruktning.Det ser nå ut til at det er en felles strukturell fold og superfamilie av proteiner assosiert med kjønnscellefusjon, og vår struktur gir et molekylært kart over dette viktige aspektet ved den menneskelige kjønnscellefusjonsmekanismen.
SPACA6 er et enkeltpasset transmembranprotein med en N-bundet glykan og seks antatte disulfidbindinger (figur S1a og S2).Vi uttrykte det ekstracellulære domenet til human SPACA6 (rester 27–246) i Drosophila S2-celler og renset proteinet ved å bruke nikkelaffinitet, kationbytte og størrelseseksklusjonskromatografi (fig. S1b).Det rensede SPACA6 ektodomenet er veldig stabilt og homogent.Analyse ved bruk av størrelseseksklusjonskromatografi kombinert med polygonal lysspredning (SEC-MALS) viste en topp med en beregnet molekylvekt på 26,2 ± 0,5 kDa (fig. S1c).Dette samsvarer med størrelsen på det monomere ektodomenet SPACA6, noe som indikerer at oligomerisering ikke skjedde under rensing.I tillegg avslørte sirkulær dikroisme (CD) spektroskopi en blandet α/β-struktur med et smeltepunkt på 51,3 °C (fig. S1d,e).Dekonvolusjon av CD-spektrene avslørte 38,6% α-heliske og 15,8% β-trådede elementer (figur S1d).
SPACA6 ektodomene ble krystallisert ved bruk av tilfeldig matrise seeding38, noe som resulterte i et datasett med en oppløsning på 2,2 Å (tabell 1 og figur S3).Ved å bruke en kombinasjon av fragmentbasert molekylær substitusjon og SAD-fasedata med bromideksponering for strukturbestemmelse (tabell 1 og figur S4), består den endelige raffinerte modellen av rester 27–246.På det tidspunktet strukturen ble bestemt, var det ingen eksperimentelle eller AlphaFold-strukturer tilgjengelig.SPACA6 ektodomenet måler 20 Å × 20 Å × 85 Å, består av syv helikser og ni β-tråder, og har en forlenget tertiær fold stabilisert av seks disulfidbindinger (fig. 1a, b).Den svake elektrontettheten ved enden av Asn243-sidekjeden indikerer at denne resten er en N-bundet glykosylering.Strukturen består av to domener: en N-terminal fire-helix-bunt (4HB) og en C-terminal Ig-lignende domene med et mellomliggende hengselområde mellom seg (fig. 1c).
a Struktur av det ekstracellulære domenet til SPACA6.Stripdiagram av det ekstracellulære domenet til SPACA6, fargen på kjeden fra N til C-terminalen fra mørk blå til mørk rød.Cysteiner involvert i disulfidbindinger er uthevet i magenta.b Topologi til det ekstracellulære domenet til SPACA6.Bruk samme fargeskjema som i figur 1a.c SPACA6 ekstracellulært domene.De 4HB-, hengsel- og Ig-lignende domenestrimmeldiagrammene er farget henholdsvis oransje, grønn og blå.Lagene er ikke tegnet i målestokk.
4HB-domenet til SPACA6 inkluderer fire hovedspiraler (helikser 1–4), som er arrangert i form av en helix (fig. 2a), alternerende mellom antiparallelle og parallelle interaksjoner (fig. 2b).En liten ekstra enkeltsvingshelix (helix 1′) legges vinkelrett på bunten, og danner en trekant med spiral 1 og 2. Denne trekanten er litt deformert i den spiralvridde pakningen til den relativt tette pakningen av spiral 3 og 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal stripediagram.b Sett ovenfra av en bunt med fire helikser, hver helix uthevet i mørkeblått ved N-terminalen og mørkerødt ved C-terminalen.c Top-down spiralhjuldiagram for 4HB, med hver rest vist som en sirkel merket med en enkeltbokstavs aminosyrekode;bare de fire aminosyrene på toppen av hjulet er nummerert.Ikke-polare rester er farget gule, polare uladede rester er farget grønne, positivt ladede rester er farget blå og negativt ladede rester er farget røde.d Trekantede flater av 4HB-domenet, med 4HBs i oransje og hengsler i grønt.Begge innlegg viser stavformede disulfidbindinger.
4HB er konsentrert på en indre hydrofob kjerne som hovedsakelig består av alifatiske og aromatiske rester (fig. 2c).Kjernen inneholder en disulfidbinding mellom Cys41 og Cys55 som binder spiral 1 og 2 sammen i en øvre hevet trekant (fig. 2d).Ytterligere to disulfidbindinger ble dannet mellom CXXC-motivet i Helix 1′ og et annet CXXC-motiv funnet på spissen av β-hårnålen i hengselregionen (fig. 2d).En konservativ argininrest med en ukjent funksjon (Arg37) befinner seg inne i en hul trekant dannet av helikser 1', 1 og 2. Alifatiske karbonatomer Cβ, Cγ og Cδ Arg37 samhandler med den hydrofobe kjernen, og dens guanidingrupper beveger seg syklisk mellom helikser 1′ og 1 via interaksjoner mellom Thr32-ryggraden og sidekjeden (fig. S5a,b).Tyr34 strekker seg inn i hulrommet og etterlater to små hulrom der Arg37 kan samhandle med løsningsmidlet.
Ig-lignende β-sandwichdomener er en stor superfamilie av proteiner som deler fellestrekket til to eller flere flertrådet amfipatiske β-ark som samhandler via en hydrofob kjerne 39. Det C-terminale Ig-lignende domenet til SPACA6 har samme mønster og består av to lag (fig. S6a).Ark 1 er et β-ark med fire tråder (strenger D, F, H og I) hvor tråder F, H og I danner et antiparallelt arrangement, og tråder I og D har en parallell interaksjon.Tabell 2 er et lite anti-parallell dobbelttrådet beta-ark (trådene E og G).En intern disulfidbinding ble observert mellom C-terminalen av E-kjeden og sentrum av H-kjeden (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Denne disulfidbindingen er analog med disulfidbindingen i β-sandwich-domenet til immunglobulin40,41.
Fire-trådet β-arket vrir seg langs hele lengden, og danner asymmetriske kanter som er forskjellige i form og elektrostatikk.Den tynnere kanten er en flat hydrofob miljøoverflate som skiller seg ut sammenlignet med de gjenværende ujevne og elektrostatisk forskjellige overflatene i SPACA6 (fig. S6b,c).En halo av eksponerte karbonyl/aminogrupper og polare sidekjeder omgir den hydrofobe overflaten (fig. S6c).Den bredere marginen er dekket av et avkortet spiralformet segment som blokkerer den N-terminale delen av den hydrofobe kjernen og danner tre hydrogenbindinger med den åpne polare gruppen til F-kjedens ryggrad (fig. S6d).Den C-terminale delen av denne kanten danner en stor lomme med en delvis eksponert hydrofob kjerne.Lommen er omgitt av positive ladninger på grunn av tre sett med doble argininrester (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 og Arg212-Arg214) og en sentral histidin (His220) (Figur S6e).
Hengselregionen er et kort segment mellom det spiralformede domenet og det Ig-lignende domenet, bestående av ett antiparallelt tretrådet β-lag (trådene A, B og C), en liten 310 helix og flere lange tilfeldige spiralsegmenter.(Fig. S7).Et nettverk av kovalente og elektrostatiske kontakter i hengselområdet ser ut til å stabilisere orienteringen mellom 4HB og det Ig-lignende domenet.Nettverket kan deles inn i tre deler.Den første delen inkluderer to CXXC-motiver (27CXXC30 og 139CXXC142) som danner et par disulfidbindinger mellom β-hårnålen i hengslet og 1′-helixen i 4HB.Den andre delen inkluderer elektrostatiske interaksjoner mellom det Ig-lignende domenet og hengslet.Glu132 i hengslet danner en saltbro med Arg233 i det Ig-lignende domenet og Arg135 i hengslet.Den tredje delen inkluderer en kovalent binding mellom det Ig-lignende domenet og hengselregionen.To disulfidbindinger (Cys124-Cys147 og Cys128-Cys153) kobler hengselsløyfen til en linker som er stabilisert av elektrostatiske interaksjoner mellom Gln131 og den funksjonelle ryggradsgruppen, noe som gir tilgang til det første Ig-lignende domenet.kjede.
Strukturen til SPACA6-ektodomenet og individuelle strukturer av 4HB og Ig-lignende domener ble brukt til å søke etter strukturelt lignende poster i proteindatabaser 42 .Vi identifiserte treff med høye Dali Z-skårer, små standardavvik og store LALI-skårer (sistnevnte er antallet strukturelt ekvivalente rester).Mens de første 10 treffene fra det fullstendige ektodomenesøket (tabell S1) hadde en akseptabel Z-score på >842, viste et søk etter 4HB eller Ig-lignende domene alene at de fleste av disse treffene tilsvarte bare β-smørbrød.en allestedsnærværende fold som finnes i mange proteiner.Alle tre søkene i Dali ga bare ett resultat: IZUMO1.
Det har lenge vært antydet at SPACA6 og IZUMO1 deler strukturelle likheter7,32,37.Selv om ektodomenene til disse to kjønnsfusjonsassosierte proteinene bare deler 21 % sekvensidentitet (figur S8a), tillot komplekse bevis, inkludert et konservert disulfidbindingsmønster og et forutsagt C-terminalt Ig-lignende domene i SPACA6, tidlige forsøk på å bygge en homologimodell av A en SPACA6-mus ved bruk av IZUMO1 som mal37.Strukturen vår bekrefter disse spådommene og viser den sanne graden av likhet.Faktisk deler SPACA6- og IZUMO137,43,44-strukturene den samme to-domene-arkitekturen (fig. S8b) med lignende 4HB- og Ig-lignende β-sandwich-domener forbundet med en hengselregion (fig. S8c).
IZUMO1 og SPACA6 4HB har vanlige forskjeller fra konvensjonelle spiralbunter.Typiske 4HB-er, som de som finnes i SNARE-proteinkomplekser involvert i endosomal fusjon 45,46, har jevnt fordelte helikser som opprettholder en konstant krumning rundt en sentral akse 47. Derimot var de spiralformede domenene i både IZUMO1 og SPACA6 forvrengt, med variabel krumning og ujevn pakking (Figur S8d).Vridningen, sannsynligvis forårsaket av trekanten dannet av heliksene 1′, 1 og 2, er beholdt i IZUMO1 og SPACA6 og stabilisert av det samme CXXC-motivet på helix 1′.Imidlertid skaper den ekstra disulfidbindingen som finnes i SPACA6 (Cys41 og Cys55 kovalent kobling av helikser 1 og 2 ovenfor) en skarpere apex ved trekantspissen, noe som gjør SPACA6 mer vridd enn IZUMO1, med mer uttalte hulromtrekanter.I tillegg mangler IZUMO1 Arg37 observert i sentrum av dette hulrommet i SPACA6.I motsetning til dette har IZUMO1 en mer typisk hydrofob kjerne av alifatiske og aromatiske rester.
IZUMO1 har et Ig-lignende domene bestående av et dobbelttrådet og femtrådet β-ark43.Den ekstra strengen i IZUMO1 erstatter spolen i SPACA6, som samhandler med F-strengen for å begrense ryggradshydrogenbindinger i strengen.Et interessant sammenligningspunkt er den forutsagte overflateladningen til de Ig-lignende domenene til de to proteinene.IZUMO1-overflaten er mer negativt ladet enn SPACA6-overflaten.En ekstra ladning er plassert nær C-terminalen som vender mot sædmembranen.I SPACA6 var de samme områdene mer nøytrale eller positivt ladet (fig. S8e).For eksempel er den hydrofobe overflaten (tynnere kanter) og positivt ladede groper (bredere kanter) i SPACA6 negativt ladet i IZUMO1.
Selv om forholdet og sekundære strukturelementer mellom IZUMO1 og SPACA6 er godt bevart, viste den strukturelle justeringen av de Ig-lignende domenene at de to domenene er forskjellige i deres generelle orientering i forhold til hverandre (fig. S9).Spiralbunten til IZUMO1 er buet rundt β-sandwichen, og skaper den tidligere beskrevne "boomerang"-formen omtrent 50° fra den sentrale aksen.Derimot ble den spiralformede strålen i SPACA6 vippet omtrent 10° i motsatt retning.Forskjellene i disse orienteringene skyldes sannsynligvis forskjeller i hengselregionen.På primærsekvensnivå deler IZUMO1 og SPACA6 liten sekvenslikhet ved hengslet, med unntak av cystein-, glycin- og asparaginsyrerester.Som et resultat er hydrogenbindinger og elektrostatiske nettverk helt forskjellige.β-sheets sekundære strukturelementer deles av IZUMO1 og SPACA6, selv om kjedene i IZUMO1 er mye lengre og 310 helix (helix 5) er unik for SPACA6.Disse forskjellene resulterer i forskjellige domeneorienteringer for to ellers like proteiner.
Vårt Dali-serversøk avslørte at SPACA6 og IZUMO1 er de eneste to eksperimentelt bestemte strukturene som er lagret i proteindatabasen som har denne spesielle 4HB-folden (tabell S1).Nylig har DeepMind (Alphabet/Google) utviklet AlphaFold, et nevralt nettverksbasert system som nøyaktig kan forutsi 3D-strukturene til proteiner fra primærsekvenser48.Kort tid etter at vi løste SPACA6-strukturen, ble AlphaFold-databasen utgitt, og ga prediktive strukturmodeller som dekker 98,5 % av alle proteiner i det menneskelige proteomet48,49.Ved å bruke vår oppløste SPACA6-struktur som en søkemodell, identifiserte et strukturelt homologisøk etter modellen i det humane AlphaFold-proteomet kandidater med mulige strukturelle likheter med SPACA6 og IZUMO1.Gitt den utrolige nøyaktigheten til AlphaFold i å forutsi SPACA6 (Fig. S10a) – spesielt 1,1 Å rms ektodomene sammenlignet med vår oppløste struktur (Fig. S10b) – kan vi være sikre på at de identifiserte SPACA6-treffene sannsynligvis vil være nøyaktige.
Tidligere søkte PSI-BLAST etter IZUMO1-klyngen med tre andre spermassosierte proteiner: IZUMO2, IZUMO3 og IZUMO450.AlphaFold spådde at disse IZUMO-familieproteinene folder seg inn i 4HB-domenet med det samme disulfidbindingsmønsteret som IZUMO1 (figur 3a og S11), selv om de mangler et Ig-lignende domene.Det antas at IZUMO2 og IZUMO3 er ensidige membranproteiner som ligner på IZUMO1, mens IZUMO4 ser ut til å bli utskilt.Funksjonene til IZUMO 2-, 3- og 4-proteiner i gametfusjon er ikke bestemt.IZUMO3 er kjent for å spille en rolle i akrosombiogenese under utvikling av sædceller51, og IZUMO-proteinet danner et kompleks50.Bevaring av IZUMO-proteiner hos pattedyr, krypdyr og amfibier antyder at deres potensielle funksjon er i samsvar med den til andre kjente gametfusjonsassosierte proteiner, som DCST1/2, SOF1 og FIMP.
Diagram over domenearkitekturen til IST-superfamilien, med 4HB, hengsel og Ig-lignende domener uthevet i henholdsvis oransje, grønt og blått.IZUMO4 har en unik C-terminal region som ser svart ut.Bekreftede og antatte disulfidbindinger er vist med henholdsvis heltrukne og stiplede linjer.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), (AlphaFold TMEMold) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) vises i samme fargeområde som panel A. Disulfidbindinger vises i magenta.TMEM95, IZUMO2 og IZUMO3 transmembranhelikser er ikke vist.
I motsetning til IZUMO-proteinet, antas andre SPACA-proteiner (dvs. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 og SPACA9) å være strukturelt forskjellige fra SPACA6 (fig. S12).Bare SPACA9 har 4HB, men det forventes ikke å ha samme parallell-anti-parallell orientering eller samme disulfidbinding som SPACA6.Bare SPACA1 har et lignende Ig-lignende domene.AlphaFold spår at SPACA3, SPACA4 og SPACA5 har en helt annen struktur enn SPACA6.Interessant nok er SPACA4 også kjent for å spille en rolle i befruktning, men i større grad enn SPACA6, og i stedet letter interaksjonen mellom sædceller og oocytt zona pellucida52.
AlphaFold-søket vårt fant et annet samsvar for IZUMO1 og SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, et enkelt sædspesifikt transmembranprotein, gjør hannmus infertile når de fjernes 32,33.Spermatozoer som manglet TMEM95 hadde normal morfologi, motilitet og evne til å penetrere zona pellucida og binde seg til eggmembranen, men kunne ikke smelte sammen med oocyttmembranen.Tidligere studier har vist at TMEM95 deler strukturelle likheter med IZUMO133.Faktisk bekreftet AlphaFold-modellen at TMEM95 er en 4HB med det samme paret av CXXC-motiver som IZUMO1 og SPACA6 og den samme ekstra disulfidbindingen mellom helikser 1 og 2 funnet i SPACA6 (fig. 3a og S11).Selv om TMEM95 mangler et Ig-lignende domene, har det et område med et disulfidbindingsmønster som ligner på SPACA6- og IZUMO1-hengselområdene (fig. 3b).På tidspunktet for publisering av dette manuskriptet rapporterte preprint-serveren strukturen til TMEM95, og bekreftet AlphaFold53-resultatet.TMEM95 er veldig lik SPACA6 og IZUMO1 og er evolusjonært bevart allerede i amfibier (fig. 4 og S13).
PSI-BLAST-søket brukte databasene NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP og SOF1 for å bestemme plasseringen av disse sekvensene i livets tre.Avstander mellom grenpunkter vises ikke i skala.
Den slående generelle strukturelle likheten mellom SPACA6 og IZUMO1 antyder at de er grunnleggende medlemmer av en bevart strukturell superfamilie som inkluderer TMEM95 og IZUMO 2, 3 og 4 proteiner.kjente medlemmer: IZUMO1, SPACA6 og TMEM95.Fordi bare noen få medlemmer har Ig-lignende domener, er kjennetegnet til IST-superfamilien 4HB-domenet, som har unike egenskaper felles for alle disse proteinene: 1) Kveilet 4HB med spiraler arrangert i en anti-parallell/parallell veksling (fig. . 5a), 2) bunten har en trekantet flate som består av to spiraler inne i bunten og en tredje vertikal helix (fig. nøkkelområde (fig. 5c). CXXC-motivet, som finnes i tioredoksinlignende proteiner, er kjent for å fungere som en redokssensor 54,55,56, mens motivet i IST-familiemedlemmer kan assosieres med proteindisulfid-isomeraser som ERp57 i gametfusjon.Roller er assosiert 57,58.
Medlemmer av IST-superfamilien er definert av tre karakteristiske trekk ved 4HB-domenet: fire helikser som veksler mellom parallell og antiparallell orientering, ba-triangulære spiralformede buntflater og et ca CXXC dobbeltmotiv dannet mellom små molekyler.) N-terminale helixer (oransje) og hengselregion β-hårnål (grønn).
Gitt likheten mellom SPACA6 og IZUMO1, ble førstnevntes evne til å binde seg til IZUMO1 eller JUNO testet.Biolagsinterferometri (BLI) er en kinetisk-basert bindingsmetode som tidligere har blitt brukt for å kvantifisere interaksjonen mellom IZUMO1 og JUNO.Etter inkubering av den biotinmerkede sensoren med IZUMO1 som agn med høy konsentrasjon av JUNO analytt, ble det oppdaget et sterkt signal (fig. S14a), som indikerer en bindingsindusert endring i tykkelsen på biomaterialet festet til sensorspissen.Lignende signaler (dvs. JUNO koblet til sensoren som et agn mot IZUMO1 analytt) (fig. S14b).Det ble ikke oppdaget noe signal når SPACA6 ble brukt som analytt mot sensorbundet IZUMO1 eller sensorbundet JUNO (figur S14a,b).Fraværet av dette signalet indikerer at det ekstracellulære domenet til SPACA6 ikke samhandler med det ekstracellulære domenet til IZUMO1 eller JUNO.
Fordi BLI-analysen er basert på biotinylering av frie lysinrester på agnproteinet, kan denne modifikasjonen forhindre binding hvis lysinrester er involvert i interaksjonen.I tillegg kan orienteringen av bindingen i forhold til sensoren skape steriske hindringer, så konvensjonelle nedtrekksanalyser ble også utført på de rekombinante SPACA6-, IZUMO1- og JUNO-ektodomene.Til tross for dette utfelte ikke SPACA6 med His-merket IZUMO1 eller His-merket JUNO (fig. S14c, d), noe som indikerer ingen interaksjon i samsvar med det som ble observert i BLI-eksperimenter.Som en positiv kontroll bekreftet vi interaksjonen til JUNO med merket His IZUMO1 (figurene S14e og S15).
Til tross for den strukturelle likheten mellom SPACA6 og IZUMO1, er manglende evne til SPACA6 til å binde JUNO ikke overraskende.Overflaten til human IZUMO1 har mer enn 20 rester som samhandler med JUNO, inkludert rester fra hver av de tre regionene (selv om de fleste av dem er lokalisert i hengselregionen) (fig. S14f).Av disse restene er bare én konservert i SPACA6 (Glu70).Mens mange restsubstitusjoner beholdt sine opprinnelige biokjemiske egenskaper, ble den essensielle Arg160-resten i IZUMO1 erstattet av den negativt ladede Asp148 i SPACA6;Tidligere studier har vist at Arg160Glu-mutasjonen i IZUMO1 nesten fullstendig opphever bindingen til JUNO43.I tillegg økte forskjellen i domeneorientering mellom IZUMO1 og SPACA6 overflatearealet til JUNO-bindingsstedet til den ekvivalente regionen på SPACA6 signifikant (fig. S14g).
Til tross for det kjente behovet for SPACA6 for gametefusjon og dets likhet med IZUMO1, ser ikke SPACA6 ut til å ha en tilsvarende JUNO-bindingsfunksjon.Derfor har vi forsøkt å kombinere våre strukturelle data med bevis på viktighet levert av evolusjonsbiologien.Sekvensjustering av SPACA6-homologer viser bevaringen av den vanlige strukturen utover pattedyr.For eksempel er cysteinrester til stede selv i fjernt beslektede amfibier (fig. 6a).Ved å bruke ConSurf-serveren ble oppbevaringsdata for flere sekvensjusteringer av 66 sekvenser kartlagt til SPACA6-overflaten.Denne typen analyse kan vise hvilke rester som har blitt bevart under proteinutvikling og kan indikere hvilke overflateregioner som spiller en rolle i funksjon.
en sekvensjustering av SPACA6 ektodomener fra 12 forskjellige arter fremstilt ved bruk av CLUSTAL OMEGA.Ifølge ConSurf-analysen er de mest konservative posisjonene markert med blått.Cysteinrester er uthevet i rødt.Domenegrenser og sekundære strukturelementer er vist øverst i linjeføringen, der piler indikerer β-tråder og bølger indikerer helikser.NCBI Access Identifiers som inneholder sekvensene er: menneske (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin ape (Cebus mimic, XP_017359366), hest (Equus caballus5, XP6_0235 killer, XP6_02ca, XP6_023) 032_034).), sau (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), hund (Canis lupus familyis, XP_025277208), mus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPi31, XPi31, XPi31, XPi31, XPi31, XPi31 ), Platypus, 8) , 61_89 og Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nummereringen er basert på menneskelig orden.b Overflaterepresentasjon av SPACA6-strukturen med 4HB øverst og Ig-lignende domene nederst, farger basert på bevaringsestimater fra ConSurf-serveren.De best bevarte delene er i blått, de moderat bevarte delene er i hvitt, og de minst bevarte er i gult.lilla cystein.Tre overflatelapper som viser et høyt beskyttelsesnivå er vist i de innfelte merkede lappene 1, 2 og 3. En 4HB tegneserie er vist i innlegget øverst til høyre (samme fargeskjema).
SPACA6-strukturen har tre svært konserverte overflateområder (fig. 6b).Patch 1 spenner over 4HB og hengselregionen og inneholder to konserverte CXXC disulfidbroer, et Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hengselnettverk (fig. S7), og tre konserverte ytre aromatiske rester (Phe31, Tyr73, Phe137)).en bredere kant av det Ig-lignende domenet (fig. S6e), som representerer flere positivt ladede rester på spermoverflaten.Interessant nok inneholder dette plasteret en antistoffepitop som tidligere har vist seg å forstyrre SPACA6 30-funksjonen.Region 3 spenner over hengslet og den ene siden av det Ig-lignende domenet;denne regionen inneholder konserverte proliner (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) og utovervendte polare/ladede rester.Overraskende nok er de fleste av restene på overflaten av 4HB svært variable (fig. 6b), selv om folden er bevart gjennom hele SPACA6-homologen (som indikert av konservatismen til den hydrofobe buntkjernen) og utover IST-superfamilien.
Selv om dette er den minste regionen i SPACA6 med færrest påvisbare sekundære strukturelementer, er mange hengselregionrester (inkludert region 3) sterkt bevart blant SPACA6-homologer, noe som kan indikere at orienteringen til den spiralformede bunten og β-sandwich spiller en rolle.som konservativ.Til tross for omfattende hydrogenbindinger og elektrostatiske nettverk i hengselregionen til SPACA6 og IZUMO1, kan imidlertid bevis på iboende fleksibilitet sees i justeringen av de flere tillatte strukturene til IZUMO137,43,44.Justeringen av de individuelle domenene overlappet godt, men orienteringen til domenene i forhold til hverandre varierte fra 50° til 70° fra sentralaksen (fig. S16).For å forstå konformasjonsdynamikken til SPACA6 i løsning, ble SAXS-eksperimenter utført (fig. S17a, b).Ab initio rekonstruksjon av SPACA6 ektodomene samsvarte med en stavkrystallstruktur (fig. S18), selv om Kratky-plottet viste en viss grad av fleksibilitet (fig. S17b).Denne konformasjonen står i kontrast til IZUMO1, der det ubundne proteinet antar en boomerangform både i gitteret og i løsningen43.
For å spesifikt identifisere den fleksible regionen ble hydrogen-deuterium-utvekslingsmassespektroskopi (H-DXMS) utført på SPACA6 og sammenlignet med data tidligere oppnådd på IZUMO143 (fig. 7a,b).SPACA6 er klart mer fleksibel enn IZUMO1, som indikert av en høyere deuteriumutveksling i hele strukturen etter 100 000 s utveksling.I begge strukturer viser den C-terminale delen av hengselregionen et høyt nivå av utveksling, som sannsynligvis tillater begrenset rotasjon av 4HB og Ig-lignende domener i forhold til hverandre.Interessant nok er den C-terminale delen av SPACA6-hengslet, bestående av 147CDLPLDCP154-resten, en svært konservert region 3 (fig. 6b), noe som muligens indikerer at interdomenefleksibilitet er et evolusjonært konservert trekk ved SPACA6.I følge fleksibilitetsanalysen viste CD termisk smeltedata at SPACA6 (Tm = 51,2°C) er mindre stabil enn IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e og S19).
a H-DXMS-bilder av SPACA6 og b IZUMO1.Den prosentvise deuteriumutvekslingen ble bestemt på de angitte tidspunktene.Nivåer av hydrogen-deuterium-utveksling er indikert med farge på en gradientskala fra blå (10 %) til rød (90 %).Svarte bokser representerer områder med høy utveksling.Grensene for 4HB, hengsel og Ig-lignende domene observert i krystallstrukturen er vist over primærsekvensen.Deuteriumutvekslingsnivåer ved 10 s, 1000 s og 100 000 s ble plottet på et stripediagram lagt over de transparente molekyloverflatene til SPACA6 og IZUMO1.Deler av strukturer med et deuteriumutvekslingsnivå under 50 % er farget hvitt.Områder over 50 % H-DXMS-utveksling er farget i en gradientskala.
Bruken av CRISPR/Cas9 og musegen knockout genetiske strategier har ført til identifisering av flere faktorer som er viktige for sæd- og eggbinding og fusjon.Bortsett fra den velkarakteriserte interaksjonen mellom IZUMO1-JUNO og CD9-strukturen, forblir de fleste av proteinene assosiert med gametefusjon strukturelt og funksjonelt gåtefulle.Den biofysiske og strukturelle karakteriseringen av SPACA6 er en annen del av det molekylære adhesjons-/fusjonspuslespillet under befruktning.
SPACA6 og andre medlemmer av IST-superfamilien ser ut til å være svært bevart i pattedyr så vel som individuelle fugler, reptiler og amfibier;faktisk antas det at SPACA6 til og med er nødvendig for befruktning i sebrafisk 59. Denne fordelingen ligner på andre kjente kjønnsfusjonsassosierte proteiner som DCST134, DCST234, FIMP31 og SOF132, noe som tyder på at disse faktorene er HAP2-mangelfulle (også kjent som GCS1) proteiner som er ansvarlige for den katalytiske aktiviteten til mange protister., planter og leddyr.Befruktede fusjonsproteiner 60, 61. Til tross for den sterke strukturelle likheten mellom SPACA6 og IZUMO1, resulterte knockout av gener som koder for ett av disse proteinene i infertilitet hos hannmus, noe som indikerer at funksjonene deres i gametfusjon ikke er duplisert..Mer generelt er ingen av de kjente sædproteinene som kreves for adhesjonsfasen av fusjon overflødige.
Det er fortsatt et åpent spørsmål om SPACA6 (og andre medlemmer av IST-superfamilien) deltar i intergametiske veikryss, danner intragametiske nettverk for å rekruttere viktige proteiner til fusjonspunkter, eller kanskje til og med fungerer som unnvikende fusogener.Samimmunutfellingsstudier i HEK293T-celler avslørte en interaksjon mellom full lengde IZUMO1 og SPACA632.Imidlertid interagerte ikke våre rekombinante ektodomener in vitro, noe som tyder på at interaksjonene sett i Noda et al.ble begge slettet i konstruksjonen (merk den cytoplasmatiske halen til IZUMO1, som har vist seg å være unødvendig for befruktning62).Alternativt kan IZUMO1 og/eller SPACA6 kreve spesifikke bindingsmiljøer som vi ikke reproduserer in vitro, for eksempel fysiologisk spesifikke konformasjoner eller molekylære komplekser som inneholder andre proteiner (kjent eller ennå ikke oppdaget).Selv om IZUMO1-ektodomenet antas å mediere binding av sædceller til egget i perivitellinerommet, er formålet med SPACA6-ektodomenet uklart.
Strukturen til SPACA6 avslører flere konserverte overflater som kan være involvert i protein-protein-interaksjoner.Den konserverte delen av hengselregionen umiddelbart ved siden av CXXC-motivet (betegnet Patch 1 ovenfor) har flere utadvendte aromatiske rester som ofte er assosiert med hydrofobe og π-stabling interaksjoner mellom biomolekyler.De brede sidene av det Ig-lignende domenet (region 2) danner et positivt ladet spor med svært konserverte Arg- og His-rester, og antistoffer mot denne regionen har tidligere blitt brukt til å blokkere kjønnscellefusjon 30 .Antistoffet gjenkjenner den lineære epitopen 212RIRPAQLTHRGTFS225, som har tre av de seks argininrestene og svært konservert His220.Det er ikke klart om dysfunksjonen skyldes blokkering av disse spesifikke restene eller hele regionen.Plasseringen av dette gapet nær C-terminalen til β-sandwichen indikerer cis-interaksjoner med nærliggende sædproteiner, men ikke med oocyttproteiner.Videre kan retensjonen av en svært fleksibel prolinrik floke (sted 3) inne i hengslet være stedet for en protein-protein-interaksjon eller, mer sannsynlig, indikere oppbevaring av fleksibilitet mellom de to domenene.Kjønn er viktig for den ukjente rollen til SPACA6.fusjon av kjønnsceller.
SPACA6 har egenskaper til intercellulære adhesjonsproteiner, inkludert Ig-lignende β-smørbrød.Mange adhesive proteiner (f.eks. cadheriner, integriner, adhesiner og IZUMO1) har ett eller flere β-sandwich-domener som strekker seg proteiner fra cellemembranen til deres miljømål63,64,65.Det Ig-lignende domenet til SPACA6 inneholder også et motiv som ofte finnes i β-sandwicher av adhesjon og kohesjon: dubletter av parallelle tråder i endene av β-smørbrød, kjent som mekaniske klemmer66.Det antas at dette motivet øker motstanden mot skjærkrefter, noe som er verdifullt for proteiner involvert i intercellulære interaksjoner.Til tross for denne likheten med adhesiner, er det foreløpig ingen bevis for at SPACA6 interagerer med eggehviter.SPACA6-ektodomenet er ikke i stand til å binde seg til JUNO, og SPACA6-uttrykkende HEK293T-celler, som vist her, samhandler knapt med oocytter som mangler zona 32.Hvis SPACA6 etablerer intergametiske bindinger, kan disse interaksjonene kreve post-translasjonelle modifikasjoner eller stabilisering av andre sædproteiner.Til støtte for sistnevnte hypotese binder IZUMO1-mangelfulle sædceller seg til oocytter, noe som viser at andre molekyler enn IZUMO1 er involvert i kjønnscelleadhesjonstrinnet 27.
Mange virale, cellulære og utviklingsmessige fusjonsproteiner har egenskaper som forutsier deres funksjon som fusogener.For eksempel har virale fusjonsglykoproteiner (klasse I, II og III) et hydrofobt fusjonspeptid eller løkke i enden av proteinet som settes inn i vertsmembranen.Hydrofilisitetskartet til IZUMO143 og strukturen (bestemt og forutsagt) til IST-superfamilien viste ingen tilsynelatende hydrofobisk fusjonspeptid.Således, hvis noen proteiner i IST-superfamilien fungerer som fusogener, gjør de det på en annen måte enn andre kjente eksempler.
Avslutningsvis forblir funksjonene til medlemmene av IST-superfamilien av proteiner assosiert med kjønnscellefusjon et fristende mysterium.Vårt karakteriserte SPACA6 rekombinante molekyl og dets oppløste struktur vil gi innsikt i forholdet mellom disse delte strukturene og deres rolle i kjønnscelletilknytning og fusjon.
DNA-sekvensen som tilsvarer det forutsagte humane SPACA6-ektodomenet (NCBI-aksessnummer NP_001303901.1; rester 27–246) ble kodonoptimalisert for ekspresjon i Drosophila melanogaster S2-celler og syntetisert som et genfragment med sekvensen som koder for Kozak (Eurofins Genomics)., BiP-sekresjonssignalet og de tilsvarende 5'- og 3'-endene for ligeringsuavhengig kloning av dette genet inn i en pMT-ekspresjonsvektor basert på en metallothionein-promoter modifisert for seleksjon med puromycin (pMT-puro).pMT-puro-vektoren koder for et trombin-spaltningssted etterfulgt av en 10x-His C-terminal tag (figur S2).
Stabil transfeksjon av SPACA6 pMT-puro vektoren inn i D. melanogaster S2 (Gibco) celler ble utført på samme måte som protokollen brukt for IZUMO1 og JUNO43.S2-celler ble tint og dyrket i Schneiders medium (Gibco) supplert med en sluttkonsentrasjon på 10 % (v/v) varmeinaktivert føtalt kalveserum (Gibco) og 1X antimykotisk antibiotikum (Gibco).Tidlig passasjeceller (3,0 x 106 celler) ble sådd ut i individuelle brønner av 6-brønns plater (Corning).Etter 24 timers inkubering ved 27°C ble cellene transfektert med en blanding av 2 mg av SPACA6 pMT-puro vektoren og Effectene transfeksjonsreagens (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll.Transfekterte celler ble inkubert i 72 timer og deretter høstet med 6 mg/ml puromycin.Celler ble deretter isolert fra komplett Schneiders medium og plassert i serumfritt Insect-XPRESS medium (Lonza) for storskala proteinproduksjon.En 1 L batch av S2-cellekultur ble dyrket til 8–10 × 106 ml-1 celler i en 2 L ventilert flatbunnet polypropylen Erlenmeyer-kolbe og deretter sterilisert med en sluttkonsentrasjon på 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) og sterilfiltrert.indusert.De induserte kulturene ble inkubert ved 27°C ved 120 rpm i fire dager.
Kondisjonert medium inneholdende SPACA6 ble isolert ved sentrifugering ved 5660 xg ved 4°C etterfulgt av et Centramate tangentiell strømningsfiltreringssystem (Pall Corp) med en 10 kDa MWCO-membran.Påfør konsentrert medium som inneholder SPACA6 på en 2 ml Ni-NTA agaroseharpiks (Qiagen) kolonne.Ni-NTA-harpiksen ble vasket med 10 kolonnevolumer (CV) buffer A og deretter ble 1 CV buffer A tilsatt for å gi en endelig imidazolkonsentrasjon på 50 mM.SPACA6 ble eluert med 10 ml buffer A supplert med imidazol til en sluttkonsentrasjon på 500 mM.Restriksjonsklasse trombin (Millipore Sigma) ble tilsatt direkte til dialyseslangen (MWCO 12-14 kDa) ved 1 enhet per mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 150 mM NaCl (buffer B) for dialyse.) ved 4°C i 48 timer.Trombin-spaltet SPACA6 ble deretter fortynnet tre ganger for å redusere saltkonsentrasjonen og lastet på en 1 ml MonoS 5/50 GL kationbytterkolonne (Cytiva/GE) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationbytteren ble vasket med 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, deretter ble SPACA6 eluert med en lineær gradient fra 0 til 500 mm NaCl i 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 for 25 OK.Etter ionebytterkromatografi ble SPACA6 konsentrert til 1 ml og eluert isokratisk fra en ENrich SEC650 10 x 300 kolonne (BioRad) ekvilibrert med buffer B. I henhold til kromatogrammet, samle og konsentratfraksjoner inneholdende SPACA6.Renheten ble kontrollert ved Coomassie-farget elektroforese på en 16% SDS-polyakrylamidgel.Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved absorbans ved 280 nm ved bruk av Beer-Lambert-loven og den teoretiske molare ekstinksjonskoeffisienten.
Renset SPACA6 ble dialysert over natten mot 10 mM natriumfosfat, pH 7,4 og 150 mM NaF og fortynnet til 0,16 mg/ml før analyse ved CD-spektroskopi.Spektralskanning av CD-er med en bølgelengde på 185 til 260 nm ble samlet på et Jasco J-1500 spektropolarimeter ved bruk av kvartskyvetter med en 1 mm optisk veilengde (Helma) ved 25°C med en hastighet på 50 nm/min.CD-spektrene ble baseline-korrigert, gjennomsnittlig over 10 anskaffelser og konvertert til gjennomsnittlig gjenværende elliptisitet (θMRE) i grader cm2/dmol:
hvor MW er molekylvekten til hver prøve i Da;N er antall aminosyrer;θ er elliptisiteten i milligrader;d tilsvarer lengden av den optiske banen i cm;proteinkonsentrasjon i enheter.